帕金森病模型大鼠腳橋核與皮層-基底節(jié)環(huán)路β振蕩網絡的研究.pdf

1、目的:本研究使用Cerebus多通道神經信號記錄系統同步記錄6-OHDA誘導的PD模型大鼠PPN、初級運動皮層(primary motor cortex，M1)和STN三個部位的局部場電位，并對這些部位的電活動進行功率譜密度、相干性以及格蘭杰因果分析，從而實現以下三個研究目的:(1)記錄研究PD模型大鼠PPN中的振蕩性電活動;(2)研究PPN的振蕩性電活動和皮層-基底節(jié)環(huán)路的振蕩性電活動之間的關系;(3)研究左旋多巴藥物對PPN和皮層-

2、基底節(jié)環(huán)路的振蕩性電活動的影響。
　　方法:1、實驗分組
　　本實驗選用健康成年的無特定病原體（Specified pathogen free，SPF）級雄性SD大鼠(Sprague Dawley rat)30只。隨機分為三組:(1)假損毀組(n=10)，右側前腦內側縱束(medial forebrain bundle，MFB)立體定向注射4μl生理鹽水;(2)損毀組(n=13)，右側MFB立體定向注射4μl6-OHDA溶液

3、（3μ上g/μl），損毀黑質致密部（substantia nigra pars compacta, SNc）多巴胺能神經元;(3)損毀+左旋多巴組(n=7)，右側MFB立體定向注射4μl6-OHDA溶液（3μg/μl），并且接受左旋多巴藥物治療。
　　2、實驗流程
　　(1)所有大鼠在多通道電極植入手術前適應性飼養(yǎng)一周，并進行轉棒行為學訓練，轉棒轉速6圈/分鐘，每天訓練3次，每次讓大鼠靜止站立于轉棒上5分鐘，接著在轉棒上行走

4、5分鐘;(2)對所有大鼠進行多通道記錄電極植入手術，同時損毀組和損毀+左旋多巴組在腦內注射6-OHDA制作PD大鼠模型，假損毀組注射等量生理鹽水;(3)術后休息恢復一周后，再次進行轉棒行為學訓練，操作同前;(4)術后兩周進行阿撲嗎啡旋轉測試，初步評估造模效果;(5)術后三周開始進行電生理記錄采集數據;(6)數據收集完畢后，處死大鼠進行組織學檢測。
　　3、模型的制作和記錄電極的植入
　　所有大鼠戊巴比妥鈉腹腔麻醉，固定于立體

5、定向儀。青霉素腹腔注射預防感染。根據Paxinos and Watson的《大鼠腦立體定向圖譜》，以前囟為參考點，計算右側MFB以及右側M1、STN、PPN的坐標，在顱骨上標記（MFB:前囟后1.8mm，中線旁開2.0mm，深度顱骨下8.3mm; M1:前囟前1.0mm，中線旁開2.3mm，顱骨下2.0mm; STN:前囟后3.5mm，中線旁開2.5mm，顱骨下8.2mm;PPN:前囟后7.8mm，中線旁開2.0mm，顱骨下7.2mm)

6、。高速渦輪牙鉆在各標記點鉆孔至硬腦膜，MFB處骨窗0.5mm，M1、STN、PPN處骨窗1.0mm，安裝6個錨定螺釘，貼至硬腦膜，固定和連接電極地線。用10μl微量注射器在損毀組和損毀+左旋多巴組大鼠右側MFB注入新鮮配制的含0.02％維生素C的6-OHDA溶液(12μg/4μl)，假損毀組右側MFB注入4μl含0.02％維生素C的生理鹽水。顯微鏡下去除M1、STN、PPN骨窗內的硬腦膜，依次在三個部位植入8導不銹鋼微絲電極。吸干顱骨表

7、面液體，牙托水泥固定電極絲，覆蓋全部顱骨并制作成電極連接的平臺。
　　4、神經電信號數據采集
　　所有大鼠在手術后三周開始進行M1、STN、PPN的局部場電位數據的采集，分別記錄大鼠在轉棒儀上靜止和行走兩種行為狀態(tài)下的電活動。微電極陣列的接口與headstages連接，使大鼠平穩(wěn)站立在轉棒上，適應片刻后保持靜止，記錄5分鐘靜止狀態(tài)下的局部場電位，接著調節(jié)轉棒儀轉速至6圈/分鐘，再記錄5分鐘行走狀態(tài)下的局部場電位。每只大鼠一共

8、記錄6次5分鐘靜止和5分鐘行走狀態(tài)下的局部場電位。記錄電活動的同時使用攝像頭錄像監(jiān)測和記錄大鼠的行為，以備后續(xù)分析。采集局部場電位時，以地線作參考，采樣率10 KHz，放大倍數300×，帶通濾波0.3-500 Hz。所有大鼠記錄6次完畢后，損毀+左旋多巴組大鼠給予腹腔注射左旋多巴（5 mg/Kg）和芐絲肼（15mg/Kg），給藥20分鐘后開始記錄局部場電位，操作同上，每只大鼠記錄6次給藥后5分鐘靜止和5分鐘行走狀態(tài)下的局部場電位。

9、>　　5、組織學
　　所有大鼠記錄完畢后腹腔麻醉，電極連接電毀損儀通以陽極直流電，使電極尖端涌出鐵離子，與亞鐵氰化鉀生成藍色絡合物定位電極尖端。開胸心臟灌注生理鹽水，直至肝臟顏色變白，換成含5％亞鐵氰化鉀的4％多聚甲醛溶液，量約400ml/只。斷頭取腦多聚甲醛外固定24小時，25％和30％蔗糖脫水，包埋劑包埋-80℃冰箱快速冷凍。切片時，先冠狀位修整腦組織平面，參照Paxinosand Watson的《大鼠腦立體定向圖譜》確定M1

10、、STN、SNc、PPN的位置，在接近各確定部位時作連續(xù)冠狀切片，每隔3張切片保留2張，M1、STN、PPN三個部位片厚40μm，SNc處片厚25μm。SNc處的切片進行TH免疫組化染色確定多巴胺能神經元損毀情況，M1、STN、PPN的切片進行尼氏染色確定電極尖端的位置。
　　6、局部場電位數據分析
　　本實驗對局部場電位的分析包括三個方面:功率譜密度（Power spectraldensity）、相干性(Coherence

11、)、格蘭杰因果分析（Granger causality analysis）。分析之前需要對數據進行初步篩選，根據組織切片染色結果，剔除電極尖端不在目標腦區(qū)或核團所屬范圍的大鼠。每只大鼠每個腦區(qū)或核團選取1-2根微電極絲所采集的噪音較少的數據，每種行為狀態(tài)（靜止或行走）選取120秒無明顯噪音、偽跡的時間段進行計算。
　　7、統計學
　　采用SPSS20.0、MATLAB和GraphadPad prism5.0進行數據統計分析和

12、作圖。假損毀組和損毀組大鼠功率譜密度的差異以及相干性的差異需要在0-100Hz上逐個頻率點進行比較，為解決多重比較問題，本實驗采用cluster-based，nonparametric permutation t-tests(n=1,000 permutations, corrected for multiplecomparisons)的方法進行統計檢驗，每個頻率點的數據采用均數±標準誤表示。β頻段的功率譜、相干性和格蘭杰因果系數在假損

13、毀組、損毀組和損毀+左旋多巴組之間的比較均采用Kruskal-Wallis test及Dunn's Multiple Comparison Test posthoc的統計檢驗方法。以P＜0.05為差異有統計學意義。
　　結果:1、損毀黑質紋狀體多巴胺神經元后功率譜密度的變化
　　在大鼠行走運動時，損毀組大鼠三個部位的β頻段功率均較假損毀組顯著增高，但各自增高的頻段范圍不完全一致，M1為15-24 Hz(P=0.042)，ST

14、N為13-28Hz(P=0.014)，PPN為14-22 Hz(P=0.035)。在大鼠靜止時，損毀組大鼠M1的β頻段功率較假損毀組顯著增高，頻率范圍為21-35 Hz(P=0.042)，而靜止時兩組大鼠STN、PPN的功率譜密度在0-100Hz上均未見顯著差異(P＞0.05)。
　　2、損毀黑質紋狀體多巴胺神經元后對相干性的影響
　　在大鼠行走運動時，損毀組大鼠三個部位兩兩之間β頻段的相干性均較假損毀組顯著增高，M1-ST

15、N為10-34 Hz(P=0.004)， M1-PPN為11-36 Hz(P=0.006)， STN-PPN為14-28 Hz(P=0.01)。在大鼠靜止時，兩組大鼠三個部位各自之間的相干性在0-100Hz上均未見顯著差異(P＞0.05)。
　　3、多巴胺能藥物治療對β頻段功率譜密度和相干性的影響
　　帕金森病模型大鼠在接受左旋多巴治療后，原本在β頻段增加的功率譜密度和相干性均降低到正常水平（P＜0.05）。
　　4、

16、β振蕩電活動格蘭杰因果分析結果
　　格蘭杰因果分析結果顯示，在STN→M1(P＜0.001)、STN→PPN(P＜0.001)和PPN→M1(P＜0.001)三個方向上，6-OHDA損毀組的β頻段格蘭杰因果系數顯著高于假損毀組和損毀+左旋多巴組;而在各自的反方向上(M1→STN、PPN→STN、M1→PPN)，三組的β頻段格蘭杰因果系數沒有顯著差異(P＞0.05)。這說明β振蕩電活動在M1、STN、PPN三個部位之間的流動方向是S

17、TN→M1、STN→PPN和PPN→M1;并且多巴胺能藥物（左旋多巴）治療后，STN→M1、STN→PPN和PPN→M1三個方向上的β頻段格蘭杰因果系數降低到正常水平。
　　結論:1、本實驗在帕金森病模型大鼠行走時記錄到了在M1、STN和PPN三個部位增強的β頻段振蕩電活動，是首次在6-OHDA帕金森病模型大鼠PPN記錄到增強的β振蕩電活動的研究。且PPN中記錄到的β振蕩電活動很有可能來自于基底節(jié)中的STN。
　　2、根據格