一種新的蛇毒解離素同系物的分離及其生物學(xué)活性的研究.pdf

1、蛇毒中含有豐富的生物活性物質(zhì)，至今在我國(guó)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的蛇類(lèi)約有219種及亞種，其中毒蛇有50種，至今只對(duì)其中少數(shù)幾種粗毒或部份純化的蛋白組份進(jìn)行了抗腫瘤作用的研究，絕大部份蛇毒抗腫瘤成份都沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)。因此，對(duì)蛇毒中生物活性成份的研究與開(kāi)發(fā)一直是我國(guó)醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域研究的重要課題。 基于上述背景，本論文是以我國(guó)華南地區(qū)富有的蝮蛇蛇毒為分離樣品源，建立快速分離純化蛇毒蛋白的方法，對(duì)蝮蛇蛇毒中分離的蛇毒蛋白組份進(jìn)行抗腫瘤活性的篩選與評(píng)價(jià)，旨在發(fā)

2、現(xiàn)新的具有生物活性的蛇毒蛋白。 本論文的主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：一、用HPLC法從蝮蛇粗毒中一次性快速分離蛋白組份AHP-4采用大孔徑C18反相硅膠柱在高效液相色譜上，0-120min內(nèi)用流動(dòng)相三氟乙酸+乙腈進(jìn)行洗脫，從蝮蛇粗毒中分離得到蛇毒蛋白組分AHP-4。 二、用HPLC法對(duì)從蝮蛇粗毒中分離的AHP-4進(jìn)行了純度測(cè)定。AHP-4在HPLC圖譜上為單一對(duì)稱峰，主峰的相對(duì)百分含量為97.1％，表明采用上述分離方法能從蝮蛇粗毒

3、中分離得到高純度的AHP-4。 三、AHP-4的分子量測(cè)定采用高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)AHP-4進(jìn)行了分子量的測(cè)定。AHP-4分子量為7554Da。 四、AHP-4的蛋白濃度測(cè)定根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和AHP-4的吸光度值，計(jì)算出AHP-4蛋白濃度為0.983μg/ml。五、AHP-4單一肽鏈結(jié)構(gòu)的測(cè)定采用非還原和還原SDS電泳法測(cè)定AHP-4的肽鏈結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，AHP-4在非還原和還原電泳條件下均為單一區(qū)帶，說(shuō)明AHP-4由單一

4、肽鏈組成。 六、AHP-4N-端部分氨基酸測(cè)定采用Edman降解測(cè)序法測(cè)定AHP-4N-端第1位至第15位的氨基酸序列，結(jié)果顯示，AHP-4N-端第1位至第15位的氨基酸序列為GEECDCGSPANPCCD。經(jīng)GeneBankprotein-proteinBLAST檢索及人工檢索，在已知蛋白質(zhì)N-端第1位至第15位氨基酸序列中，未發(fā)現(xiàn)與AHP-4氨基酸結(jié)構(gòu)完全相同的蛋白質(zhì)。而AHP-4N端第1位至第15位氨基酸序列與5種解離素中

5、的氨基酸序列具有高度同源性，表明AHP-4是一種新的解離素同系物 七、AHP-4對(duì)體外ADP誘導(dǎo)的兔血小板聚集的作用用ADP作為誘導(dǎo)劑，觀察AHP-4在體外對(duì)兔血小板聚集的結(jié)果表明，AHP-4劑量依賴性的抑制ADP誘導(dǎo)的兔血小板聚集，IC50為4.607nM。 八、AHP-4對(duì)人肝癌Hep3B細(xì)胞抗腫瘤活性的形態(tài)學(xué)變化通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化來(lái)觀察AHP-4在體外對(duì)人肝癌Hep3B細(xì)胞的抗腫瘤活性結(jié)果表明，AHP-4在3.88

6、μg/ml、16.9μg/ml和33.8μg/ml劑量時(shí)，能誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的病理變化，表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤活性，并有劑量依賴性。 九、AHP-4對(duì)Hep3B細(xì)胞抗腫瘤作用機(jī)制的探討基因芯片的結(jié)果表明，AHP-4能上調(diào)或下調(diào)許多與腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)基因的表達(dá)。其中AHP-4抑制五種整合素(integrinα2、α3、α4、β3和β5)基因的表達(dá)和促進(jìn)兩種整合素(integrinα6和αv)基因的表達(dá)，抑制表皮生長(zhǎng)因子EGF和

7、受體EGFR基因的表達(dá)，以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶9、組織抑制型基質(zhì)金屬蛋白酶1表達(dá)，可能與其抗腫瘤作用的機(jī)制有關(guān)。 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本論文的結(jié)論如下：一、本實(shí)驗(yàn)采用高效液相方法，從蝮蛇蛇毒中分離出一種新的解離素同系物。結(jié)構(gòu)確認(rèn)的結(jié)果表明，AHP-4的分子量為7554Da，是由一條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)，N-端第1位至第15位的氨基酸序列為GEECDCGSPANPCCD。經(jīng)GeneBankprotein-proteinBLAST檢索及

8、人工檢索，在已知蛋白質(zhì)N-端第1位至第15位氨基酸序列中，未發(fā)現(xiàn)與AHP-4氨基酸結(jié)構(gòu)完全相同的蛋白質(zhì)。AHP-4N端第1位至第15位氨基酸序列與5種解離素中的氨基酸序列具有高度同源性，表明AHP-4是一種新的解離素同系物。 二、AHP-4在體外能劑量依賴性地抑制誘導(dǎo)劑二磷酸腺苷(ADP)誘導(dǎo)的兔血小板聚集，IC50為4.607nM，說(shuō)明AHP-4和大多數(shù)解離素一樣，具有抑制血小板聚集的作用。 三、AHP-4在體外對(duì)人肝

9、癌Hep3B細(xì)胞有較強(qiáng)的抗腫瘤活性。形態(tài)學(xué)結(jié)果表明，細(xì)胞在AHP-4處理后，使單層貼壁生長(zhǎng)的Hep3B細(xì)胞出現(xiàn)網(wǎng)狀樣結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)病理變化，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，病變加重，直至細(xì)胞全部漂浮。AHP-4的上述抗腫瘤活性有明顯的劑量依賴性。 四、用基因芯片方法探討AHP-4抗腫瘤作用機(jī)理的初步結(jié)果表明，AHP-4能抑制五種整合素(integrinα2、α3、α4、β3和β5)基因的表達(dá)，促進(jìn)兩種整合素(integrinα6和αv)基因的表達(dá)；