多巴胺對丘腦室旁核的神經(jīng)支配及其受體D3在PTSD大鼠丘腦室旁核內(nèi)表達的變化.pdf

1、丘腦中線及板內(nèi)核群與大腦的認(rèn)知、注意力和覺醒機制有關(guān)。該核群內(nèi)的每個核團都各自獨立地有限定性地投射到不同的大腦皮質(zhì)區(qū)域以及不同的紋狀體亞區(qū)。這些丘腦核團也被認(rèn)為是某些具有特殊功能的回路的一部分，其功能主要是與認(rèn)知、情感和與生存相關(guān)的行為有關(guān)。
　　丘腦室旁核(paraventricular nucleus of thalamus; PVT)是丘腦中線及板內(nèi)核群的一員。PVT在這一核群中的特殊性是其在腹部紋狀體的伏核(nucleus

2、accumbens; NAc)有很密集的投射，而伏核與控制獎勵和動機有密切關(guān)聯(lián)。此外，PVT還中等程度地投射到伏核的所有主要上級神經(jīng)核團，包括內(nèi)側(cè)前額皮質(zhì)（腹側(cè)前額皮質(zhì)及下邊緣皮質(zhì)），海馬回腹下角，以及基底外側(cè)杏仁核。PVT具有的以上解剖學(xué)特性提示，PVT可能對獎勵和動機行為有較強的影響。近期已有研究表明，PVT參與和覓藥及獎勵有關(guān)的行為。例如，嚙齒類動物在二次接觸與可卡因用藥相關(guān)聯(lián)的環(huán)境或線索時，其PVT內(nèi)的cFos表達增高;PVT失

3、活后，可卡因引起的復(fù)吸、自我給藥以及條件性位置偏愛效應(yīng)均被減弱。同時，與此研究結(jié)果相似，覓酒精的嚙齒類動物在經(jīng)歷由環(huán)境或線索引起的復(fù)用后，其PVT內(nèi)的cFos也會增高;滅活PVT也會減弱由環(huán)境引起的酒精復(fù)用。此外，PVT內(nèi)的cFos表達在有可預(yù)測蔗糖獎勵的線索出現(xiàn)時會增高也提示PVT參與食物獎勵行為。
　　腹側(cè)被蓋區(qū)(VTA)的多巴胺神經(jīng)元及其對伏核的支配與獎勵和動機行為等功能有關(guān)聯(lián)。而PVT內(nèi)也被證實含有酪氨酸羥化酶(TH)染色

4、陽性的神經(jīng)纖維，該酶是參與多巴胺合成的限速酶。在背部丘腦中線及板內(nèi)核群中，PVT是最富含免疫反應(yīng)陽性多巴胺纖維的核團。因此，PVT很有可能是調(diào)節(jié)多巴胺獎勵功能的神經(jīng)回路的一部分(VTA-PVT-NAc)?，F(xiàn)有的兩篇研究大鼠PVT內(nèi)多巴胺纖維來源的文章給出相反的結(jié)論，其一認(rèn)為VTA是PVT內(nèi)多巴胺支配的主要來源，而另一篇認(rèn)為是來自下丘腦。造成這一差異的部分原因可能是由于兩個研究的逆向示蹤劑的注射位置有所不同;同時我們也很難評估這些研究，因

5、為文章沒有圖示出明確的示蹤劑注射位置，所以也就很難從這些文章中得出肯定的結(jié)論。
　　PVT的解剖和生理功能的重要性已經(jīng)被越來越多的學(xué)者所重視，因此明確識別PVT內(nèi)多巴胺投射的來源對更準(zhǔn)確地理解PVT與獎勵行為的關(guān)聯(lián)有十分重要的意義。本研究就是應(yīng)用顯微離子電滲透注射技術(shù)將逆向示蹤劑霍亂病毒B(CTb)注射到大鼠的aPVT或pPVT內(nèi)后，通過免疫組化雙標(biāo)記法來描繪出由PVT逆向追蹤到的多巴胺雙標(biāo)細胞(TH/CTb)的分布模式。

6、　　目的：
　　另外，PVT是背側(cè)丘腦核群中唯一一個調(diào)控包括杏仁核、伏核及下邊緣皮質(zhì)等在內(nèi)的核團。而這些邊緣系統(tǒng)核團均參與恐懼、焦慮及獎勵行為的調(diào)控。有研究表明，腹腔注射D3受體拮抗劑能夠減弱大鼠的條件性恐懼的表達。而PVT內(nèi)的主要多巴胺受體是D3受體，其含量遠高于其他背側(cè)丘腦核團。因此，PVT很有可能是D3受體拮抗劑減弱恐懼表達的作用靶點。本研究利用創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(post-traumatic stress disorder，P

7、TSD)大鼠模型來考察PVT內(nèi)的D3受體表達是否在應(yīng)激恐懼狀態(tài)下會有所改變。
　　方法：
　　1、逆向示蹤劑顯微離子電滲透定位注射
　　將麻醉后的大鼠放置于立體定位儀上，去除相應(yīng)部位頭骨暴露腦組織，將一根含有逆向示蹤劑CTb的玻璃顯微針降至PVT。在玻璃針內(nèi)放入一經(jīng)氯化處理的銀線，連通0.5-2.5μA、200 ms脈沖、2 Hz電流進行離子電滲透注射15分鐘。大鼠復(fù)蘇后常規(guī)飼養(yǎng)，10-12天后再次深度麻醉，經(jīng)心臟多聚

8、甲醛灌流后取腦。取50μm厚度的PVT部位的腦片進行CTb免疫組化染色，確定注射位置是否在PVT內(nèi)。
　　2、免疫組化檢測雙標(biāo)記細胞的分布模式
　　取含CTb注射位置（aPVT或pPVT內(nèi)）的鼠腦的自由浮動腦片在封閉液內(nèi)預(yù)孵后，將其轉(zhuǎn)移至CTb和TH一抗混合物內(nèi)室溫過夜。然后經(jīng)過CTb二抗、ABC、DAB染黑色后，再次經(jīng)過TH二抗、ABC、DAB（不含強化鎳）染棕色后貼片并封片，干燥后在顯微鏡下查找雙標(biāo)細胞(TH/CTb)及

9、其的分布模式。
　　3、足底電擊PTSD大鼠模型制作
　　大鼠(n=30)被單獨依次放入電擊箱內(nèi)，5分鐘內(nèi)接受5次電擊，每次持續(xù)2秒鐘，電擊強度為1.5 mA，電擊間隔時間隨機在10-50秒之間。對照組大鼠(n=10)被放進電擊箱內(nèi)停留等量時間，但是不給予電擊。電擊后第二天，將每只大鼠單獨放入一曠場內(nèi)6分鐘，在后3分鐘播放一個9 KHz，75dB的全程音。然后根據(jù)后3分鐘木僵時間百分比（后3分鐘內(nèi)木僵時間/全程6分鐘）的大小

10、，將被電擊大鼠分為高反應(yīng)組(HR)和低反應(yīng)組(LR)。
　　4、PTSD大鼠丘腦室旁核內(nèi)多巴胺D3受體的變化
　　電擊14天后，將40只大鼠按不同組別（未電擊、HR、LR）平均分配成兩組，將動物麻醉后快速灌流、迅速斷頭、取腦，在解剖顯微鏡下分離出PVT。提取并純化mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用實時定量PCR方法檢測多巴胺D3受體的變化，同時將個體的Drd3 mRNA值與其電擊后第二天的木僵百分比進行相關(guān)性比較。
　　結(jié)

11、果：
　　一、逆向示蹤劑定位注射
　　在所有60例CTb注射的大鼠中，我們選出4例CTb在PVT內(nèi)的注射核心完全在aPVT內(nèi)，以及4例完全在pPVT內(nèi)的大鼠進行了分析。在被選用的所有的案例中，最密集的CTb標(biāo)記核心均占據(jù)大部分的PVT，個別注射位置包含了小部分周邊核團。
　　二、雙標(biāo)細胞的分布模式
　　1、TH/CTb雙標(biāo)細胞主要分布于下丘腦的A15、A13和A11多巴胺細胞團。
　　2、雙標(biāo)細胞還散在地分

12、布于未定帶外側(cè)區(qū)域、A12、穹窿周圍下丘腦、A10vr以及水管周灰質(zhì)。
　　3、在VTA(A10)、中腦黑質(zhì)(A9)及中腦網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)尾部(A8)內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)任何雙標(biāo)細胞。
　　三、足底電擊PTSD大鼠模型的建立
　　1、多數(shù)未電擊鼠的木僵反應(yīng)等于或接近于零，而電擊鼠的木僵時間百分比的個體差異很大。電擊鼠的木僵時間百分比＜40％的大鼠被選擇到低反應(yīng)組，而木僵時間百分比＞60％的大鼠被選擇到高反應(yīng)組。木僵時間百分比位于40％到

13、60％之間的大鼠未被本實驗采用。
　　2、單因素方差分析(one-way ANOVA)結(jié)果顯示，電擊組電擊后第二天的在新環(huán)境中的木僵反應(yīng)明顯高于未電擊鼠，三組大鼠之間的差異具有顯著性。LSD事后檢驗結(jié)果顯示，HR的木僵時間百分比明顯高于未電擊鼠和LR，未電擊鼠和LR之間也有顯著差異。
　　四、PTSD大鼠丘腦室旁核內(nèi)多巴胺D3受體的變化
　　單因素方差分析(one-way ANOVA)結(jié)果表明，電擊后第14天大鼠PVT

14、內(nèi)多巴胺D3受體的mRNA表達在未電擊鼠、LR、HR之間存在顯著差異。LSD事后檢驗結(jié)果顯示HR大鼠PVT內(nèi)的D3受體mRNA水平明顯高于LR。而且電擊鼠的Drd3 mRNA值與其電擊后第二天的木僵百分比呈顯著正相關(guān)性。
　　結(jié)論：
　　1、大鼠PVT內(nèi)的多巴胺傳入纖維主要來自于下丘腦的A11、A13及A15細胞團以及水管周灰質(zhì)，而并非來自VTA(A10)、中腦黑質(zhì)(A9)或中腦網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)尾部(A8)。
　　2、足底電擊