多巴胺對(duì)丘腦室旁核的神經(jīng)支配及其受體D3在PTSD大鼠丘腦室旁核內(nèi)表達(dá)的變化.pdf

1、丘腦中線(xiàn)及板內(nèi)核群與大腦的認(rèn)知、注意力和覺(jué)醒機(jī)制有關(guān)。該核群內(nèi)的每個(gè)核團(tuán)都各自獨(dú)立地有限定性地投射到不同的大腦皮質(zhì)區(qū)域以及不同的紋狀體亞區(qū)。這些丘腦核團(tuán)也被認(rèn)為是某些具有特殊功能的回路的一部分，其功能主要是與認(rèn)知、情感和與生存相關(guān)的行為有關(guān)。
　　丘腦室旁核(paraventricular nucleus of thalamus; PVT)是丘腦中線(xiàn)及板內(nèi)核群的一員。PVT在這一核群中的特殊性是其在腹部紋狀體的伏核(nucleus

2、accumbens; NAc)有很密集的投射，而伏核與控制獎(jiǎng)勵(lì)和動(dòng)機(jī)有密切關(guān)聯(lián)。此外，PVT還中等程度地投射到伏核的所有主要上級(jí)神經(jīng)核團(tuán)，包括內(nèi)側(cè)前額皮質(zhì)（腹側(cè)前額皮質(zhì)及下邊緣皮質(zhì)），海馬回腹下角，以及基底外側(cè)杏仁核。PVT具有的以上解剖學(xué)特性提示，PVT可能對(duì)獎(jiǎng)勵(lì)和動(dòng)機(jī)行為有較強(qiáng)的影響。近期已有研究表明，PVT參與和覓藥及獎(jiǎng)勵(lì)有關(guān)的行為。例如，嚙齒類(lèi)動(dòng)物在二次接觸與可卡因用藥相關(guān)聯(lián)的環(huán)境或線(xiàn)索時(shí)，其PVT內(nèi)的cFos表達(dá)增高;PVT失

3、活后，可卡因引起的復(fù)吸、自我給藥以及條件性位置偏愛(ài)效應(yīng)均被減弱。同時(shí)，與此研究結(jié)果相似，覓酒精的嚙齒類(lèi)動(dòng)物在經(jīng)歷由環(huán)境或線(xiàn)索引起的復(fù)用后，其PVT內(nèi)的cFos也會(huì)增高;滅活PVT也會(huì)減弱由環(huán)境引起的酒精復(fù)用。此外，PVT內(nèi)的cFos表達(dá)在有可預(yù)測(cè)蔗糖獎(jiǎng)勵(lì)的線(xiàn)索出現(xiàn)時(shí)會(huì)增高也提示PVT參與食物獎(jiǎng)勵(lì)行為。
　　腹側(cè)被蓋區(qū)(VTA)的多巴胺神經(jīng)元及其對(duì)伏核的支配與獎(jiǎng)勵(lì)和動(dòng)機(jī)行為等功能有關(guān)聯(lián)。而PVT內(nèi)也被證實(shí)含有酪氨酸羥化酶(TH)染色

4、陽(yáng)性的神經(jīng)纖維，該酶是參與多巴胺合成的限速酶。在背部丘腦中線(xiàn)及板內(nèi)核群中，PVT是最富含免疫反應(yīng)陽(yáng)性多巴胺纖維的核團(tuán)。因此，PVT很有可能是調(diào)節(jié)多巴胺獎(jiǎng)勵(lì)功能的神經(jīng)回路的一部分(VTA-PVT-NAc)?，F(xiàn)有的兩篇研究大鼠PVT內(nèi)多巴胺纖維來(lái)源的文章給出相反的結(jié)論，其一認(rèn)為VTA是PVT內(nèi)多巴胺支配的主要來(lái)源，而另一篇認(rèn)為是來(lái)自下丘腦。造成這一差異的部分原因可能是由于兩個(gè)研究的逆向示蹤劑的注射位置有所不同;同時(shí)我們也很難評(píng)估這些研究，因

5、為文章沒(méi)有圖示出明確的示蹤劑注射位置，所以也就很難從這些文章中得出肯定的結(jié)論。
　　PVT的解剖和生理功能的重要性已經(jīng)被越來(lái)越多的學(xué)者所重視，因此明確識(shí)別PVT內(nèi)多巴胺投射的來(lái)源對(duì)更準(zhǔn)確地理解PVT與獎(jiǎng)勵(lì)行為的關(guān)聯(lián)有十分重要的意義。本研究就是應(yīng)用顯微離子電滲透注射技術(shù)將逆向示蹤劑霍亂病毒B(CTb)注射到大鼠的aPVT或pPVT內(nèi)后，通過(guò)免疫組化雙標(biāo)記法來(lái)描繪出由PVT逆向追蹤到的多巴胺雙標(biāo)細(xì)胞(TH/CTb)的分布模式。

6、　　目的：
　　另外，PVT是背側(cè)丘腦核群中唯一一個(gè)調(diào)控包括杏仁核、伏核及下邊緣皮質(zhì)等在內(nèi)的核團(tuán)。而這些邊緣系統(tǒng)核團(tuán)均參與恐懼、焦慮及獎(jiǎng)勵(lì)行為的調(diào)控。有研究表明，腹腔注射D3受體拮抗劑能夠減弱大鼠的條件性恐懼的表達(dá)。而PVT內(nèi)的主要多巴胺受體是D3受體，其含量遠(yuǎn)高于其他背側(cè)丘腦核團(tuán)。因此，PVT很有可能是D3受體拮抗劑減弱恐懼表達(dá)的作用靶點(diǎn)。本研究利用創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(post-traumatic stress disorder，P

7、TSD)大鼠模型來(lái)考察PVT內(nèi)的D3受體表達(dá)是否在應(yīng)激恐懼狀態(tài)下會(huì)有所改變。
　　方法：
　　1、逆向示蹤劑顯微離子電滲透定位注射
　　將麻醉后的大鼠放置于立體定位儀上，去除相應(yīng)部位頭骨暴露腦組織，將一根含有逆向示蹤劑CTb的玻璃顯微針降至PVT。在玻璃針內(nèi)放入一經(jīng)氯化處理的銀線(xiàn)，連通0.5-2.5μA、200 ms脈沖、2 Hz電流進(jìn)行離子電滲透注射15分鐘。大鼠復(fù)蘇后常規(guī)飼養(yǎng)，10-12天后再次深度麻醉，經(jīng)心臟多聚

8、甲醛灌流后取腦。取50μm厚度的PVT部位的腦片進(jìn)行CTb免疫組化染色，確定注射位置是否在PVT內(nèi)。
　　2、免疫組化檢測(cè)雙標(biāo)記細(xì)胞的分布模式
　　取含CTb注射位置（aPVT或pPVT內(nèi)）的鼠腦的自由浮動(dòng)腦片在封閉液內(nèi)預(yù)孵后，將其轉(zhuǎn)移至CTb和TH一抗混合物內(nèi)室溫過(guò)夜。然后經(jīng)過(guò)CTb二抗、ABC、DAB染黑色后，再次經(jīng)過(guò)TH二抗、ABC、DAB（不含強(qiáng)化鎳）染棕色后貼片并封片，干燥后在顯微鏡下查找雙標(biāo)細(xì)胞(TH/CTb)及

9、其的分布模式。
　　3、足底電擊PTSD大鼠模型制作
　　大鼠(n=30)被單獨(dú)依次放入電擊箱內(nèi)，5分鐘內(nèi)接受5次電擊，每次持續(xù)2秒鐘，電擊強(qiáng)度為1.5 mA，電擊間隔時(shí)間隨機(jī)在10-50秒之間。對(duì)照組大鼠(n=10)被放進(jìn)電擊箱內(nèi)停留等量時(shí)間，但是不給予電擊。電擊后第二天，將每只大鼠單獨(dú)放入一曠場(chǎng)內(nèi)6分鐘，在后3分鐘播放一個(gè)9 KHz，75dB的全程音。然后根據(jù)后3分鐘木僵時(shí)間百分比（后3分鐘內(nèi)木僵時(shí)間/全程6分鐘）的大小

10、，將被電擊大鼠分為高反應(yīng)組(HR)和低反應(yīng)組(LR)。
　　4、PTSD大鼠丘腦室旁核內(nèi)多巴胺D3受體的變化
　　電擊14天后，將40只大鼠按不同組別（未電擊、HR、LR）平均分配成兩組，將動(dòng)物麻醉后快速灌流、迅速斷頭、取腦，在解剖顯微鏡下分離出PVT。提取并純化mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)多巴胺D3受體的變化，同時(shí)將個(gè)體的Drd3 mRNA值與其電擊后第二天的木僵百分比進(jìn)行相關(guān)性比較。
　　結(jié)

11、果：
　　一、逆向示蹤劑定位注射
　　在所有60例CTb注射的大鼠中，我們選出4例CTb在PVT內(nèi)的注射核心完全在aPVT內(nèi)，以及4例完全在pPVT內(nèi)的大鼠進(jìn)行了分析。在被選用的所有的案例中，最密集的CTb標(biāo)記核心均占據(jù)大部分的PVT，個(gè)別注射位置包含了小部分周邊核團(tuán)。
　　二、雙標(biāo)細(xì)胞的分布模式
　　1、TH/CTb雙標(biāo)細(xì)胞主要分布于下丘腦的A15、A13和A11多巴胺細(xì)胞團(tuán)。
　　2、雙標(biāo)細(xì)胞還散在地分

12、布于未定帶外側(cè)區(qū)域、A12、穹窿周?chē)虑鹉X、A10vr以及水管周灰質(zhì)。
　　3、在VTA(A10)、中腦黑質(zhì)(A9)及中腦網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)尾部(A8)內(nèi)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何雙標(biāo)細(xì)胞。
　　三、足底電擊PTSD大鼠模型的建立
　　1、多數(shù)未電擊鼠的木僵反應(yīng)等于或接近于零，而電擊鼠的木僵時(shí)間百分比的個(gè)體差異很大。電擊鼠的木僵時(shí)間百分比＜40％的大鼠被選擇到低反應(yīng)組，而木僵時(shí)間百分比＞60％的大鼠被選擇到高反應(yīng)組。木僵時(shí)間百分比位于40％到

13、60％之間的大鼠未被本實(shí)驗(yàn)采用。
　　2、單因素方差分析(one-way ANOVA)結(jié)果顯示，電擊組電擊后第二天的在新環(huán)境中的木僵反應(yīng)明顯高于未電擊鼠，三組大鼠之間的差異具有顯著性。LSD事后檢驗(yàn)結(jié)果顯示，HR的木僵時(shí)間百分比明顯高于未電擊鼠和LR，未電擊鼠和LR之間也有顯著差異。
　　四、PTSD大鼠丘腦室旁核內(nèi)多巴胺D3受體的變化
　　單因素方差分析(one-way ANOVA)結(jié)果表明，電擊后第14天大鼠PVT

14、內(nèi)多巴胺D3受體的mRNA表達(dá)在未電擊鼠、LR、HR之間存在顯著差異。LSD事后檢驗(yàn)結(jié)果顯示HR大鼠PVT內(nèi)的D3受體mRNA水平明顯高于LR。而且電擊鼠的Drd3 mRNA值與其電擊后第二天的木僵百分比呈顯著正相關(guān)性。
　　結(jié)論：
　　1、大鼠PVT內(nèi)的多巴胺傳入纖維主要來(lái)自于下丘腦的A11、A13及A15細(xì)胞團(tuán)以及水管周灰質(zhì)，而并非來(lái)自VTA(A10)、中腦黑質(zhì)(A9)或中腦網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)尾部(A8)。
　　2、足底電擊