基因工程化的系膜細(xì)胞系移植在體外及體內(nèi)監(jiān)測(cè)急性腎小球腎炎.pdf

1、腎小球腎炎是慢性腎衰的常見(jiàn)原因之一。目前，沒(méi)有一種手段能夠連續(xù)性地、無(wú)侵襲性地評(píng)估腎小球腎炎。單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)在很多種類的腎小球腎炎的發(fā)病中都起重要作用1。在病理?xiàng)l件下，活化的巨噬細(xì)胞釋放出一系列的炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致腎小球損傷的起始和進(jìn)展2。監(jiān)測(cè)巨噬細(xì)胞-系膜細(xì)胞間相互作用對(duì)于評(píng)估腎小球腎炎的活性和明了腎小球損傷的機(jī)制是很重要的。我們將kB增強(qiáng)子片段引導(dǎo)的分泌性堿性磷酸酶(SEAP)穩(wěn)定地導(dǎo)入系膜細(xì)胞。本研究的目的在于確定這個(gè)建立的系統(tǒng)能否

2、在體外監(jiān)測(cè)巨噬細(xì)胞一系膜細(xì)胞間的相互作用；將這個(gè)系膜細(xì)胞系移植到大鼠體內(nèi)后，它能否在體內(nèi)監(jiān)測(cè)局部的腎小球炎癥。 實(shí)驗(yàn)方法： 克隆系膜細(xì)胞系SM43是從雄性SD大鼠的腎小球分離的。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)全部采用清潔級(jí)成年雄性SD大鼠(日本山梨大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物部)。主要儀器設(shè)備：Gene Light 55熒光照度儀，超凈臺(tái)，CO2細(xì)胞孵育器，CR5B2離心機(jī)，BAS-2500型放射自顯影機(jī)，電泳儀。主要試劑有SEAP檢測(cè)試劑盒，抗-Thy

3、1.1單克隆抗體1-22-311，pNFkB-SEAP質(zhì)粒。主要藥物有IL-1β、TNF-α和MG132。 首先進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將pNFKB-SEAP質(zhì)粒(5μg)和pcDNA3.1質(zhì)粒(1μg)轉(zhuǎn)染5×105個(gè)SM43系膜細(xì)胞。上述質(zhì)量與0.25M的CaCl2400μl混合，短時(shí)間快速振蕩，之后與2xBBS400μl混合并振蕩30分鐘到1小時(shí)，直到出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的沉淀物后，在4℃條件下放置約2到3小時(shí)。隨后將混合液轉(zhuǎn)入上述培養(yǎng)皿內(nèi)并攪

4、拌。約16小時(shí)后，更換培養(yǎng)液；24小時(shí)后，用濃度是330μg/ml的G418(一種新霉素)來(lái)選擇穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，可引導(dǎo)性最高、背景影響最小的一個(gè)克隆被選出，以進(jìn)行下面的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。我們將該克隆命名為SM/NFkB-SEAPS。使用同樣的方法，用pSEAP2-對(duì)照質(zhì)粒和pcDNA3.1質(zhì)粒，我們又建立了SM/SV-SEAF28細(xì)胞系。pSEAP2-對(duì)照質(zhì)粒編碼SV40早啟動(dòng)子和增強(qiáng)子引導(dǎo)的SEAP。本實(shí)驗(yàn)僅使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的20代到35代細(xì)胞。

5、建立大鼠腎炎模型：在成年雄性SD大鼠(體重250-300克)，將1ml單克隆抗體1-22-3經(jīng)尾靜脈注入，建立抗-Thy 1.1腎小球腎炎模型。 篩網(wǎng)法分離腎小球：將正常大鼠或腎炎大鼠(抗體注入后第4天)的腎臟很好地研碎，序列地通過(guò)三個(gè)不銹鋼篩網(wǎng)，篩網(wǎng)的孔徑直徑分別是180、125、106μm,然后用0-4℃PBS收集腎小球。 細(xì)胞移植：1×106個(gè)已經(jīng)貼壁生長(zhǎng)的SM/NFkB-SEAP5細(xì)胞被胰蛋白酶解離，放在1ml含

6、1％FBS的培養(yǎng)液內(nèi)，4℃放置。大鼠右側(cè)臥位，經(jīng)左側(cè)腹壁打開(kāi)腹腔，分離出腎門血管，經(jīng)左腎動(dòng)脈將細(xì)胞注入到正?；蚰I炎大鼠(腎炎后第一天)的腎臟內(nèi)。 腎小球腎炎的體內(nèi)監(jiān)測(cè)：將大鼠分為5組：1.正常大鼠、2.移植了感受細(xì)胞的正常大鼠、3.腎炎大鼠、4.移植了感受細(xì)胞的腎炎大鼠、5.腹膜細(xì)胞移植組。第1、3、6、8和10天從尾靜脈采血，然后分離血清，做SEAP分析。每組至少有4-6只大鼠。 實(shí)驗(yàn)一首先用免疫熒光方法判定細(xì)胞的特性

7、；然后體外實(shí)驗(yàn)觀察該細(xì)胞系監(jiān)測(cè)巨噬細(xì)胞-系膜細(xì)胞間的相互作用情況。主要用SEAP活性測(cè)定法檢測(cè)培養(yǎng)液中SEAP活性，Northern測(cè)定SEAP mRNA水平。 實(shí)驗(yàn)二采用基因工程化的感受細(xì)胞系移植，在體內(nèi)監(jiān)測(cè)急性腎小球腎炎。主要用SEAP括性測(cè)定法檢測(cè)血清和培養(yǎng)液中SEAP活性，Northern測(cè)定SEAPmRNA水平。 實(shí)驗(yàn)三以實(shí)驗(yàn)一及實(shí)驗(yàn)二的特殊發(fā)現(xiàn)為依據(jù)，利用共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和交互飼育實(shí)驗(yàn)探求NF-kB信號(hào)途徑在體外培

8、養(yǎng)的正常腎小球是否自發(fā)性地活化，以及MAPK與NF-kB信號(hào)活化的關(guān)系。 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：以3孔細(xì)胞或4孔細(xì)胞為一組進(jìn)行分析。大鼠分組則是4到6只為一組。資料的表示方法是平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。用非參數(shù)性Mann-Whitney U檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。認(rèn)為p<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 實(shí)驗(yàn)一：建立的感受細(xì)胞在接受系膜細(xì)胞標(biāo)記物抗α平滑肌肌動(dòng)蛋白單克隆抗體(1:100)染色和抗Thy 1.1單克隆抗體(1:100)染色

9、時(shí)，呈陽(yáng)性。在前炎性因子IL-1p刺激感受性系膜細(xì)胞時(shí)，Northern分析和SEAP活性測(cè)定都表明SEAP水平以時(shí)間和濃度依賴的方式增加。不同于KB增強(qiáng)子片段的刺激物IL-1(3和TNF-α,TRE的刺激物TPA,CRE的刺激物forskolin以及SRE的刺激物PDGF一BB都不能誘導(dǎo)出'SEAP水平的提高。在暴露于活化的巨噬細(xì)胞的感受細(xì)胞，Northern可以觀察到明顯的SEAP mRNA的誘導(dǎo)。同樣，可以在兩種細(xì)胞的共培養(yǎng)液中檢

10、測(cè)到顯著的SEAP活性(有巨噬細(xì)胞組80,318±2,365 RLU;沒(méi)有巨噬細(xì)胞組2,075±82 RLU，二者相比有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異)。這種誘導(dǎo)可以被NF -KB抑制劑MG132完全抑制(782±141 RLU，與巨噬細(xì)胞組相比，也有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異)。 實(shí)驗(yàn)二：熒光顯微鏡下，通過(guò)DiI染色標(biāo)記的方式，證明:在有感受細(xì)胞移植的左側(cè)腎臟分離的腎小球，可以明顯地看到感受細(xì)胞的積聚;而在沒(méi)有感受細(xì)胞移植的右側(cè)腎臟分離的腎小球，沒(méi)有看到

11、感受細(xì)胞的積聚。具體數(shù)據(jù)分析是:在有感受細(xì)胞移植的左腎，DiI陽(yáng)性染色的腎小球的比例是90.8±2.9％。在沒(méi)有感受細(xì)胞移植的右腎，觀察不到陽(yáng)性染色的腎小球，二者有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。另一個(gè)克隆細(xì)胞系SM/SV一SEAP28細(xì)胞體內(nèi)移植后，血清SEAP分析顯示了血清中的SEAP水平以注人細(xì)胞數(shù)目依賴的方式升高。這說(shuō)明SEAP可以在體內(nèi)被作為一個(gè)報(bào)告分子，而且可以從血清中檢測(cè)到。在SM/NFKB-SEAP5細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)中，血清SEAP在第3到

12、6天達(dá)到最高值，隨后開(kāi)始下降(3天時(shí)是基礎(chǔ)值的3.46±0.44倍，6天時(shí)是基礎(chǔ)值的3.47土0.85倍)。甚至于在細(xì)胞移植第10天以后，也可以從腎小球中再培養(yǎng)出許多新霉素耐受的感受細(xì)胞。而且，當(dāng)向腎炎大鼠腹腔內(nèi)注射感受細(xì)胞時(shí)，并不能監(jiān)測(cè)到血清SEAP水平的升高，說(shuō)明移植的細(xì)胞只能監(jiān)測(cè)局部的炎癥。如上的結(jié)果提示:用一種腎小球局部存在的生物感受系統(tǒng)選擇性并持續(xù)性地評(píng)估腎小球腎炎是可行的。 實(shí)驗(yàn)三:在體外培養(yǎng)的正常的腎小球，可以發(fā)現(xiàn)

13、MCP-1的自發(fā)生成。共同培養(yǎng)和交互飼育實(shí)驗(yàn)都顯示:分離的正常的腎小球自發(fā)地產(chǎn)生自分泌/旁分泌因子，促進(jìn)SM43細(xì)胞MCP-1的生成。MG132明顯抑制MCP-1的生成。這說(shuō)明MCP-1的誘導(dǎo)也是依賴于NF-κβ信號(hào)傳導(dǎo)途徑的。與SM/NFκβ-SEAP5系膜細(xì)胞系的共同培養(yǎng)和交互飼育實(shí)驗(yàn)都顯示:體外培養(yǎng)的腎小球的確產(chǎn)生自分泌/旁分泌因子，這些因子激活NF-κβ信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)。當(dāng)PD098059 (50 μM, ERK抑制劑)或SB203

14、580 (25 μM;p38MAPK抑制劑)存在于培養(yǎng)液中時(shí)，在感受細(xì)胞與腎小球共培養(yǎng)24小時(shí)以后，這兩種藥物都能明顯地降低來(lái)自于SM/NFκβ-SEAP5感受細(xì)胞的SEAP的分泌。 結(jié)論： 1.我們建立了一個(gè)基因工程化的感受細(xì)胞系，它可以在KB增強(qiáng)子的引導(dǎo)下，制造和分泌SEAP。當(dāng)受到巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的前炎性因子的刺激時(shí)，或直接受到活化的巨噬細(xì)胞的刺激時(shí)，可以觀察到SEAP分泌的明顯的升高。交互飼育研究表明:在培養(yǎng)液中存在

15、活化的巨噬細(xì)胞集聚的炎性腎小球釋放的可溶性因子的時(shí)候，感受細(xì)胞可以分泌SEAP。細(xì)胞移植研究表明感受細(xì)胞在活化的巨噬細(xì)胞存在的炎性腎小球內(nèi)分泌SEAP。我們的這些數(shù)據(jù)說(shuō)明了這個(gè)建立的系統(tǒng)可以在體外監(jiān)測(cè)巨噬細(xì)胞一系膜細(xì)胞的相互作用。 2.當(dāng)建立的系膜細(xì)胞系經(jīng)腎動(dòng)脈被移植到患有腎炎的大鼠體內(nèi)后，血清SEAP水平明顯升高。血清SEAP的動(dòng)態(tài)變化與腎小球腎炎的活動(dòng)程度明顯相關(guān)，在藥物干預(yù)性治療后血清SEAP水平下降?？傊?，在體內(nèi)用基因工