水中產(chǎn)ESBL耐熱大腸菌及耐藥基因在小鼠腸道中的轉(zhuǎn)歸研究.pdf

1、近年來,隨著抗生素的大量運(yùn)用,耐藥菌的加劇出現(xiàn)成為嚴(yán)重影響人類健康的一個(gè)重要安全問題。產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶(Extended-spectrumβ-lactamases,ESBL)菌株1983年被Kliebe.C首次報(bào)道后,國際上對(duì)其的關(guān)注日益增多。產(chǎn)ESBL菌株在患者體內(nèi)、畜牧、家禽、昆蟲和環(huán)境中的不斷檢出,尤其是新型產(chǎn)ESBL菌株的不斷發(fā)現(xiàn),都提示產(chǎn)ESBL菌株業(yè)已成為當(dāng)前的一類廣泛流行的微生物,并已經(jīng)和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(met

2、hicillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA),耐萬古霉素腸球菌(Vancomycin resistant Enterococcus,VRE)一并成為目前臨床上威脅最大的三大菌株。產(chǎn)ESBL菌株主要為革蘭氏陰性桿菌,大多數(shù)通過質(zhì)粒介導(dǎo)。由于革蘭氏陰性桿菌繁殖速度快,細(xì)菌群體效應(yīng)密切,因此導(dǎo)致編碼ESBL的質(zhì)粒在菌株之間的轉(zhuǎn)移相對(duì)陽性菌株更加容易,且發(fā)生變異的機(jī)會(huì)也更大。目前,世界上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了

3、近300多種編碼ESBL基因(bla基因),這類菌株的耐藥譜提示此類菌株的耐藥類型幾乎覆蓋了目前所有的常用抗生素,其造成的感染會(huì)給臨床治療帶來極大的困難。
　　 水環(huán)境作為耐藥基因傳播的媒介,其龐大的耐藥基因庫,為進(jìn)入該環(huán)境中的致病菌及條件致病菌提供獲得大量耐藥基因的機(jī)會(huì),一旦這些致病菌再次入侵人體,引起感染,將會(huì)造成難以預(yù)計(jì)的后果。耐熱大腸菌群作為水中致病菌的指示菌,具有易培養(yǎng),易鑒別,數(shù)量眾多的優(yōu)點(diǎn),可以客觀地反映水中菌株的

4、耐藥情況。同時(shí),由于耐熱大腸菌株來源于溫血?jiǎng)游锏哪c道,同腸道固有菌群具有遺傳上的相似性,因此在細(xì)菌間交流對(duì)話和基因交換方面具有更加便利的條件,這樣也會(huì)造成耐藥型耐熱大腸菌群成為耐藥基因的儲(chǔ)存庫,通過基因轉(zhuǎn)移將耐藥基因傳遞到其他菌株,形成潛在的健康危害。本課題將從水中的產(chǎn)ESBL耐熱大腸菌株為切入點(diǎn),研究其在地表水中的分布情況,耐藥特點(diǎn)及耐藥相關(guān)基因元件的攜帶規(guī)律,并通過耐藥基因的體內(nèi)轉(zhuǎn)歸規(guī)律研究,探討水中產(chǎn)ESBL菌株在水環(huán)境中的衛(wèi)生學(xué)

5、特點(diǎn),以及此類菌株在進(jìn)入人體后可能帶來的健康危害,為控制水源性耐藥菌的污染,預(yù)防耐藥菌引起的介水傳染病,保障公共衛(wèi)生安全提供科學(xué)依據(jù)。
　　 一、水中產(chǎn)ESBL耐熱大腸菌群耐藥譜及耐藥基因型研究
　　 我室前期已經(jīng)發(fā)現(xiàn),醫(yī)院污水是地表水中的產(chǎn)ESBL菌株的主要來源,由于醫(yī)院污水中的耐藥菌具有致病菌多,耐藥譜廣的特點(diǎn),我們推測,醫(yī)院污水中產(chǎn)ESBL菌株在進(jìn)入地表水體后,其所攜帶的耐藥相關(guān)基因元件將會(huì)在陰性菌株中發(fā)生散播,造

6、成耐藥菌株的大范圍擴(kuò)散。因此,了解水中產(chǎn)ESBL菌株的菌種、耐藥譜特點(diǎn)和產(chǎn)ESBL耐藥基因型特點(diǎn),對(duì)于掌握重慶地區(qū)長江地表水中產(chǎn)ESBL菌的污染水平,以及其可能造成的耐藥性擴(kuò)散危害,將提供十分重要的背景數(shù)據(jù)。
　　 本實(shí)驗(yàn)從從長江地表水重慶市區(qū)段2公里的江面上,于2007至2009年分三次采集水樣,分離水中耐熱大腸菌群,通過產(chǎn)ESBL確證實(shí)驗(yàn)獲得產(chǎn)ESBL耐熱大腸菌,使用細(xì)菌菌種鑒定系統(tǒng)鑒定樣本菌株菌種,測定對(duì)一線常用19種抗生

7、素的MIC值,并使用特定的引物,PCR檢測TEM、SHV、CTX-M和OXA四種產(chǎn)ESBL基因的攜帶情況。本實(shí)驗(yàn)共從重慶段長江地表水收集得到1914株水源性耐熱大腸菌群,其中342株對(duì)頭孢噻肟耐藥,經(jīng)過產(chǎn)ESBL確證實(shí)驗(yàn)共獲得319株產(chǎn)ESBL菌株,占水中耐熱大腸菌的16.7％。所有菌株均呈現(xiàn)多重耐藥性,對(duì)19種一線抗生素有不同程度耐藥,僅對(duì)阿米卡星和亞胺培南敏感率較高,通過分析樣本菌株的bla基因型發(fā)現(xiàn),CTX-M是水中產(chǎn)ESBL耐熱

8、大腸菌的主要的bla基因型,但是菌株以復(fù)合基因型為主要構(gòu)成主體,同本地臨床報(bào)道有較大差距。其中CTX-M+TEM占有較大比例(30.4％),其次是CTX-M+SHV(9.1％)和SHV+TEM(6.0％),未發(fā)現(xiàn)OXA基因型。結(jié)果顯示,重慶段長江地表水中產(chǎn)ESBL菌株污染情況較為嚴(yán)重,呈現(xiàn)耐藥譜廣,耐藥基因型復(fù)雜的特點(diǎn),提示此類菌株在水中可能成為耐藥基因的主要儲(chǔ)存載體,地表水環(huán)境可能成為耐藥基因重新組合的重要場所。
　　 二、水

9、中產(chǎn)ESBL耐熱大腸菌群中整合子攜帶情況研究
　　 整合子是細(xì)菌特別是革蘭陰性菌基因中,一種能識(shí)別且俘獲移動(dòng)性基因盒,并有位點(diǎn)特異性的重組表達(dá)系統(tǒng)的可移動(dòng)基因元件(mobile gene elements,MGEs)。整合子本身無法移動(dòng),但常出現(xiàn)在轉(zhuǎn)座子,接合性質(zhì)粒,噬菌體或細(xì)菌染色體上,共同作為可自行移動(dòng)的載體,捕獲和整合耐藥基因,形成巨大的多基因座(loci),并隨細(xì)菌的繁殖復(fù)制到子代DNA中。其所攜帶的基因盒可以編碼對(duì)多種

10、抗生素的耐藥性,因此整合子被認(rèn)為是同菌株多重耐藥密切相關(guān)的一類MGEs。目前已知的整合子可以分為1、2、3、4類,其中1類整合子被認(rèn)為在耐藥基因的轉(zhuǎn)移過程中占主要作用。本課題在前期發(fā)現(xiàn)產(chǎn)ESBL菌株呈現(xiàn)高度的多重耐藥趨勢的基礎(chǔ)上,結(jié)合此類菌株對(duì)非產(chǎn)β-內(nèi)酰胺類抗生素也具有較高的的耐藥比例的特征,推測水中產(chǎn)ESBL菌株可能和整合子有著密切的聯(lián)系,因此研究水中產(chǎn)ESBL菌株中整合子的的攜帶規(guī)律,對(duì)于掌握產(chǎn)ESBL菌株多重耐藥的原因和特點(diǎn),摸

11、清此類菌株的耐藥規(guī)律,揭示其可能產(chǎn)生的衛(wèi)生學(xué)危害,具有重要意義。
　　 通過對(duì)產(chǎn)ESBL耐熱大腸菌進(jìn)行1、2、3類整合酶擴(kuò)增,并擴(kuò)增和測序分析整合酶陽性菌株中耐藥基因盒區(qū)域,發(fā)現(xiàn)319株樣本菌株中,含有1類整合子比例較高,達(dá)65.2％。僅有3株菌株攜帶有2類整合子,未發(fā)現(xiàn)3類整合子的存在。3株攜帶2類整合子的菌株同時(shí)也攜帶1類整合子。通過分析整合子包含的耐藥基因盒區(qū)域發(fā)現(xiàn),208株整合酶陽性菌株中,共有117株整合子陽性菌株攜帶

12、有耐藥基因盒區(qū)域,具有9種不同的片段長度,其余菌株未檢測到擴(kuò)增產(chǎn)物。通過對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序分析共檢測到13種耐藥基因盒,其中aadA家族和dfrA家族是產(chǎn)ESBL菌株中最常見的耐藥基因盒,1.8kb片段中dfrA17-aadA5的耐藥基因盒組合形式出現(xiàn)頻率最高,且序列片段大小相對(duì)固定。結(jié)果提示,1類整合子在產(chǎn)ESBL菌株中存在幾率較高,整合子中攜帶的耐藥基因種類廣泛,可能是造成此類菌株的多重耐藥性的重要原因。耐藥基因盒區(qū)域的相對(duì)固定表明

13、,整合子在產(chǎn)ESBL菌株中可能作為一個(gè)保守的固有元件,進(jìn)行整體傳播,形成耐藥性的擴(kuò)散,整合子的保守性可能使其成為儲(chǔ)存耐藥基因的重要形式。
　　 三、水源性產(chǎn)ESBL菌株在小鼠腸道內(nèi)的定植情況研究
　　 四、用于研究耐藥基因腸道轉(zhuǎn)移的新型小鼠模型的建立
　　 五、水源性產(chǎn)ESBL菌株所攜帶耐藥基因在小鼠模型內(nèi)的轉(zhuǎn)移規(guī)律研究
　　 六、結(jié)論和創(chuàng)新點(diǎn)
　　 長江作為重慶的主干水流,已經(jīng)受到產(chǎn)ESBL耐藥

14、菌的嚴(yán)重污染,水中耐藥菌的檢出水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他地區(qū)。產(chǎn)ESBL耐熱大腸菌呈現(xiàn)高度的多重耐藥特點(diǎn),對(duì)于目前臨床和畜牧業(yè)上常用的一線抗生素均有不同程度的耐藥,其中整合子可能在多重耐藥性上發(fā)揮了重要作用。通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)我們證實(shí),水中產(chǎn)ESBL耐熱大腸菌由于其適應(yīng)腸道生活環(huán)境,且同腸道菌群之間關(guān)系密切,因此在進(jìn)入動(dòng)物腸道后能夠定植并繁殖,并通過糞便持續(xù)性排出體外。同時(shí),水源性產(chǎn)ESBL菌株還可以將所攜帶的耐藥基因轉(zhuǎn)移給腸道固有菌,形成耐藥菌種類擴(kuò)

15、散,結(jié)腸環(huán)境是發(fā)生基因轉(zhuǎn)移的重要場所。本課題提示,需要嚴(yán)格控制污染源中耐藥菌的排放水平,加強(qiáng)對(duì)地表水中耐藥菌的監(jiān)控力度,進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)飲水安全的措施保障,為防止耐藥菌在水環(huán)境中的擴(kuò)散,預(yù)防介水傳染病的發(fā)生提供有力支持。
　　 重慶作為一個(gè)長江上游地區(qū)發(fā)達(dá)的綜合性城市,其耐藥菌的產(chǎn)生和排放嚴(yán)重影響長江的水質(zhì)。長江為重慶城區(qū)的主要飲水來源,且是下游三峽庫區(qū)的重要主干水流,長江水中的菌株耐藥情況同人群的健康關(guān)系密切。本課題在目前國內(nèi)首次

16、關(guān)注長江地表水中產(chǎn)ESBL耐熱大腸菌的背景資料,并通過耐藥譜、整合子、腸道定植、耐藥基因轉(zhuǎn)移等實(shí)驗(yàn),從多個(gè)方面客觀闡述了此類菌株在水中的分布特征及對(duì)動(dòng)物腸道菌群的潛在危害,具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。同時(shí),本課題也是國內(nèi)外率先通過重組腸道固有菌構(gòu)建用于研究耐藥基因體內(nèi)轉(zhuǎn)移的動(dòng)物模型,并通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有一定的應(yīng)用效果,為耐藥基因的相關(guān)研究提供了一定的科學(xué)依據(jù)和實(shí)驗(yàn)積累。
　　 七、問題與展望:
　　 本研究僅針對(duì)水源性耐熱大腸菌群

17、進(jìn)行研究,而產(chǎn)ESBL菌株所涵蓋的范圍極廣,不但包括了腸桿菌科,還包括了擬桿菌、假單胞菌等,因此僅僅研究腸桿菌科中耐熱大腸菌群的產(chǎn)ESBL菌株特性還不能說明水中整體耐藥菌株的特性。此外,我們在研究中發(fā)現(xiàn),雖然臨床報(bào)道表明2類整合子在臨床分離株中攜帶比例也在一個(gè)較高水平,但是我們的樣本菌株中僅發(fā)現(xiàn)3株菌株攜帶有2類整合子,提示耐熱大腸菌株可能對(duì)于1類整合子有偏好,而較少的捕獲2類整合子。因此,后期如果能對(duì)耐熱大腸菌株對(duì)于1類整合子的捕獲偏