水環(huán)境中產(chǎn)ESBL腸桿菌耐藥質粒在小鼠腸道內水平轉移的分子機理.pdf

1、合理使用抗生素能夠治療人類和動物的感染性疾病，然而臨床中濫用和過度使用抗生素加劇了耐藥菌的出現(xiàn)，甚至“超級細菌”的產(chǎn)生。超廣譜β-內酰胺酶(extended-spectrum beta-lactamases,ESBLs)主要是質粒編碼的一類酶，能夠水解青霉素類、頭孢菌素類和氨曲南等抗生素，但不能水解頭霉素類(如頭孢西丁、頭孢替坦)或碳青霉烯類，可被克拉維酸、舒巴坦和他唑巴坦所抑制。全球流行的ESBLs主要包括SHV型、TEM型和CTX-

2、M型。CTX-M型是目前最主要的β-內酰胺酶類型。
　　ESBLs主要在腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，腸桿菌是人和動物腸道內正常菌群，也是院內和社區(qū)感染的重要病原體。人和動物源的耐藥菌通過排放最終進入到水環(huán)境中，其耐藥基因可能在水環(huán)境的細菌之間進一步擴散。水被認為是耐藥基因重要的存儲庫。因此，一旦產(chǎn)ESBL腸桿菌通過污染的食物或飲用水進入到人和動物腸道內，很可能導致耐藥基因在人和動物體內傳播，甚至造成嚴重的感染。
　　質粒在腸桿菌之間具有潛

3、在的轉移能力，很可能導致超級毒力或耐藥菌株出現(xiàn)，在耐藥性的進化和散播過程中起著重要的作用，但至今其轉移機制尚不明確。為了了解不同水環(huán)境中產(chǎn)ESBL腸桿菌的流行情況及其來源，以及攜帶ESBLs的耐藥質粒在小鼠腸道內水平轉移的分子機理，我們開展了以下研究。
　　1.泰安農(nóng)村井水中產(chǎn)ESBL腸桿菌的流行及特點
　　為了解泰安農(nóng)村井水中產(chǎn)ESBL腸桿菌的流行及特點。從4/100(4％)個采樣井中，共分離到10株產(chǎn)ESBL腸桿菌，包括

4、9株大腸桿菌和1株肺炎克雷伯菌。ESBL基因型結果顯示9株菌為CTX-M-15，1株菌為CTX-M-27。5/8株CTX-M-15產(chǎn)ESBL大腸桿菌屬于ST10，在人糞便中經(jīng)常檢測到。值得注意的是，僅有1株CTX-M-27型大腸桿菌的多位點序列分型屬于B2:131(ST131)，可能與人類和動物的嚴重感染有關。
　　2.館陶地區(qū)農(nóng)村蓄水池中產(chǎn)ESBL腸桿菌的多重耐藥性
　　對館陶地區(qū)農(nóng)村蓄水池中產(chǎn)ESBL腸桿菌進行分離并分析

5、其特點。采集的30個蓄水池中，有5個(16.7%)分離檢測到產(chǎn)ESBL腸桿菌。本研究中分離到66株ESBL表型陽性的非重復性菌株。菌種鑒定結果為42株為大腸桿菌，17株為肺炎克雷伯菌，4株植生拉烏爾菌、3株陰溝腸桿菌。20株菌含有單一的bla基因，包括CTX-M型(17株)、TEM(2株)和SHV(1株)；46株菌同時含有兩種或三種bla基因。所有產(chǎn)ESBL腸桿菌均表現(xiàn)多重耐藥性。這些結果表明館陶地區(qū)的農(nóng)村蓄水池已被產(chǎn)ESBL腸桿菌嚴重

6、污染。
　　3.泰安黃前水庫中產(chǎn)ESBL耐熱腸桿菌的耐藥性及整合子特點
　　我們以產(chǎn)ESBL耐熱大腸菌(extended-spectrumβ-lactamases-producing thermotolerant coliforms,ESBL-TC)為指示菌，對泰安黃前水庫中分離的ESBL-TC的耐藥性、bla基因型、整合子(1、2、3類)及基因盒的特點進行分析。共分離到96株非重復性ESBL-TC菌株，ESBL基因包括bl

7、aCTX-M-14(n=47),blaCTX-M-15(n=27),blaCTX-M-55(n=18),blaSHV-12(n=4),blaCTX-M-3(n=3),and blaCTX-M-123(n=1)。其中83株含有1類整合子(86.5％)，2株含有2類整合子，整合子基因盒的大小在0.2 kb至3.2 kb之間。該結果表明，黃前水庫已被ESBL-TC嚴重污染，成為耐藥基因的儲存器。
　　4.泰安健康農(nóng)村居民中糞便攜帶CTX

8、-M型產(chǎn)ESBL腸桿菌的高流行率及風險因素分析
　　為了解泰安地區(qū)農(nóng)村健康居民糞便中CTX-M型ESBL腸桿菌科細菌的攜帶情況及相關風險因素。從農(nóng)村居民中共收集620份糞便樣本，篩選CTX-M陽性腸桿菌，并應用標準統(tǒng)計方法對糞便攜帶的相關風險因素進行分析。458株攜帶CTX-M的腸桿菌(458/620，73.9%)分離于不同的人，最主要的基因型為CTX-M-9組(303/458，66.2%)。攜帶CTX-M基因的腸桿菌中，主要為大

9、腸桿菌(403/458，88%)和肺炎克雷伯菌(26、458、5.7%)。所有CTX-M陽性菌株都對氨芐西林、頭孢唑林、頭孢呋辛、頭孢曲松耐藥，但都對比阿培南、亞胺培南、美羅培南敏感。多變量邏輯回歸模型分析結果：受正規(guī)教育(OR2.321;95%CI1.302–3.768;P=0.039)，過去6個月內的住院情況(OR1.753;95% CI1.127–2.584;P=0.031)和過去6個月內抗生素的使用(OR1.892;95% CI

10、1.242–2.903;P=0.034)，這三個變量與CTX-M型產(chǎn)ESBL陽性菌株攜帶者具有顯著相關性(x2=21.21;df=3;P＜0.001)。泰安市健康農(nóng)村居民的糞便攜帶CTX-M型產(chǎn)ESBL腸桿菌糞便的流行率高，主要與近期抗生素的使用和住院情況有關。
　　5.從豬和養(yǎng)殖工作人員分離的產(chǎn)ESBL大腸桿菌的特性
　　食品性動物一直被認為產(chǎn)ESBL大腸桿菌的存儲器。為分析和比較豬源與豬場工作人員中攜帶的產(chǎn)ESBL大腸桿

11、菌的特點，從4個育肥豬場中采集60頭豬的肛門棉拭子(15個樣品/豬場)，并采集40個豬場工作人員的直腸棉拭子(10人/豬場)。從以下幾個方面對分離的產(chǎn)ESBL大腸桿菌進行分析：ESBL基因型，耐藥譜，ERIC和多位點序列分型。自60份豬肛門棉拭子中分離到34株產(chǎn)ESBL陽性大腸桿菌，20.0%(8/40份)的工作人員棉拭子為產(chǎn)ESBL大腸桿菌陽性。更重要的是，同一豬場內豬源和工作人員中分離到的產(chǎn)ESBL大腸桿菌菌株具有相同的β-內酰胺酶

12、基因、耐藥譜、ERIC型以及相同的ST型。結果表明在動物與人之間可能存在產(chǎn)ESBL大腸桿菌的傳播。
　　6. ESBLs耐藥質粒全序列分析
　　編碼ESBLs基因通常位于質粒上，并通過接合、轉座作用轉移和傳播。我們挑選了一株水源攜帶CTX-M-15基因的大腸桿菌W121，進行體外耐藥質粒接合轉移，并對質粒DNA全序列分析。攜帶的CTX-M-15耐藥性質粒Tp采用鳥槍法構建文庫方法進行DNA測序并利用生物信息學方法分析了其編碼

13、基因和結構。質粒Tp全長為94495 bp，屬于IncI1質粒不相容性分組。質粒全序列上共含有116個預測基因，僅攜帶兩個已知耐藥基因blaCTX-M-15和blaTEM-1。Tp的基本結構與質粒R64非常的相似，骨架之間共線性主要位于轉移區(qū)域，并且同樣含有大腸桿菌素Ib基因。耐藥質粒Tp可看作由轉座子Tn3介導的ISEcp1-blaCTX-M-15相關元件嵌合體。類似Tp質粒上兩個不同β-內酰胺酶基因的同時轉座，會導致耐藥基因的廣泛傳

14、播，具有重要的公共衛(wèi)生學意義，需進一步研究。
　　7.水源產(chǎn)ESBL大腸桿菌在小鼠腸道內滯留
　　應用小鼠腸道定植模型，檢測水源產(chǎn)ESBL大腸桿菌耐藥基因在體內的定植能力以及抗生素對產(chǎn)ESBL大腸桿菌在腸道內滯留的影響。小鼠接觸的飲用水污染濃度越高，耐藥菌在腸道內滯留的時間越長，但最終會低于檢測水平。在抗生素(頭孢菌素)處理的小鼠中，水源大腸桿菌在腸道內定植水平為108 cfu/g；未給予抗生素的小鼠中，由于小鼠腸道固有菌群

15、的定植拮抗作用，耐藥菌迅速下降至檢測限以下，但再給予抗生素治療后，耐藥菌直接達到可檢測水平并上升至108 cfu/g糞便。此外，在小鼠腸道內定植期間可檢測到耐藥質粒的轉移，blaCTX-M和blaTEM基因可同時轉移至腸道固有腸桿菌中?？傊茨退幋竽c桿菌能夠很好地在腸道內定植，攜帶的質粒在體內具有轉移能力?？股刂委熡欣谀退幘倪x擇生長及腸道內的定植，增強了耐藥基因庫，最終提高了耐藥基因的傳播風險。
　　8.水源產(chǎn)ESBL大腸

16、桿菌耐藥基因在炎癥小鼠腸道內的水平轉移
　　首先建立小鼠腸道炎癥模型。在沙門氏菌感染的鏈霉素處理小鼠模型中，小鼠腸道炎癥促進了供體菌(108-1011 cfu/g糞便)和受體菌(108-1010 cfu/g糞便)在腸道內的共同大量增值。在大量增值的狀態(tài)下，檢測供體菌與受體菌之間質粒Tp的轉移接合率，結果發(fā)現(xiàn)接合菌(TCs)幾乎等于受體菌在腸道內的水平，且轉移率高達近100%，顯著高于正常腸道組。說明在5dpi幾乎所有的受體菌都接受

17、了質粒成為TCs。在正常腸道小鼠模型中，由于腸道內定植拮抗，供體菌、受體菌的水平顯著低于腸道炎癥組小鼠，接合菌的水平也遠遠低于受體菌。總之，炎癥引發(fā)腸道內腸桿菌的大量繁殖，使得供體菌和受體菌的密度比正常哺乳動物腸道內提高了100多倍。這促進了不同腸桿菌之間遺傳物質的重排和轉移，表明感染的病人體內更容易發(fā)生質粒編碼的耐藥因子的擴散轉移(如ESBL)。
　　9.水源產(chǎn)ESBL大腸桿菌在小鼠腸道內質粒水平轉移的分子機制
　　哺乳動

18、物腸道內含有大量的微生物菌群，這些微生物菌群可以通過質粒水平轉移的方式與入侵微生物之間進行基因的交換，導致超級毒力或耐藥的菌株出現(xiàn)，但至今其轉移機制尚不明確。為了更確切地證明是否在水源大腸桿菌(E.coli W121)與腸道固有大腸桿菌之間發(fā)生了質粒水平轉移，以及從分子生物學角度探討其水平轉移的機制。首先利用生物信息學將Tp質粒與固有大腸桿菌(EC615)所接受的質粒比較，發(fā)現(xiàn)EC615質粒(Tpinv)與Tp質粒同源性為＞99%，唯一