水環(huán)境中產(chǎn)ESBL腸桿菌耐藥質(zhì)粒在小鼠腸道內(nèi)水平轉(zhuǎn)移的分子機(jī)理.pdf

1、合理使用抗生素能夠治療人類和動(dòng)物的感染性疾病，然而臨床中濫用和過(guò)度使用抗生素加劇了耐藥菌的出現(xiàn)，甚至“超級(jí)細(xì)菌”的產(chǎn)生。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum beta-lactamases,ESBLs)主要是質(zhì)粒編碼的一類酶，能夠水解青霉素類、頭孢菌素類和氨曲南等抗生素，但不能水解頭霉素類(如頭孢西丁、頭孢替坦)或碳青霉烯類，可被克拉維酸、舒巴坦和他唑巴坦所抑制。全球流行的ESBLs主要包括SHV型、TEM型和CTX-

2、M型。CTX-M型是目前最主要的β-內(nèi)酰胺酶類型。
　　ESBLs主要在腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，腸桿菌是人和動(dòng)物腸道內(nèi)正常菌群，也是院內(nèi)和社區(qū)感染的重要病原體。人和動(dòng)物源的耐藥菌通過(guò)排放最終進(jìn)入到水環(huán)境中，其耐藥基因可能在水環(huán)境的細(xì)菌之間進(jìn)一步擴(kuò)散。水被認(rèn)為是耐藥基因重要的存儲(chǔ)庫(kù)。因此，一旦產(chǎn)ESBL腸桿菌通過(guò)污染的食物或飲用水進(jìn)入到人和動(dòng)物腸道內(nèi)，很可能導(dǎo)致耐藥基因在人和動(dòng)物體內(nèi)傳播，甚至造成嚴(yán)重的感染。
　　質(zhì)粒在腸桿菌之間具有潛

3、在的轉(zhuǎn)移能力，很可能導(dǎo)致超級(jí)毒力或耐藥菌株出現(xiàn)，在耐藥性的進(jìn)化和散播過(guò)程中起著重要的作用，但至今其轉(zhuǎn)移機(jī)制尚不明確。為了了解不同水環(huán)境中產(chǎn)ESBL腸桿菌的流行情況及其來(lái)源，以及攜帶ESBLs的耐藥質(zhì)粒在小鼠腸道內(nèi)水平轉(zhuǎn)移的分子機(jī)理，我們開(kāi)展了以下研究。
　　1.泰安農(nóng)村井水中產(chǎn)ESBL腸桿菌的流行及特點(diǎn)
　　為了解泰安農(nóng)村井水中產(chǎn)ESBL腸桿菌的流行及特點(diǎn)。從4/100(4％)個(gè)采樣井中，共分離到10株產(chǎn)ESBL腸桿菌，包括

4、9株大腸桿菌和1株肺炎克雷伯菌。ESBL基因型結(jié)果顯示9株菌為CTX-M-15，1株菌為CTX-M-27。5/8株CTX-M-15產(chǎn)ESBL大腸桿菌屬于ST10，在人糞便中經(jīng)常檢測(cè)到。值得注意的是，僅有1株CTX-M-27型大腸桿菌的多位點(diǎn)序列分型屬于B2:131(ST131)，可能與人類和動(dòng)物的嚴(yán)重感染有關(guān)。
　　2.館陶地區(qū)農(nóng)村蓄水池中產(chǎn)ESBL腸桿菌的多重耐藥性
　　對(duì)館陶地區(qū)農(nóng)村蓄水池中產(chǎn)ESBL腸桿菌進(jìn)行分離并分析

5、其特點(diǎn)。采集的30個(gè)蓄水池中，有5個(gè)(16.7%)分離檢測(cè)到產(chǎn)ESBL腸桿菌。本研究中分離到66株ESBL表型陽(yáng)性的非重復(fù)性菌株。菌種鑒定結(jié)果為42株為大腸桿菌，17株為肺炎克雷伯菌，4株植生拉烏爾菌、3株陰溝腸桿菌。20株菌含有單一的bla基因，包括CTX-M型(17株)、TEM(2株)和SHV(1株)；46株菌同時(shí)含有兩種或三種bla基因。所有產(chǎn)ESBL腸桿菌均表現(xiàn)多重耐藥性。這些結(jié)果表明館陶地區(qū)的農(nóng)村蓄水池已被產(chǎn)ESBL腸桿菌嚴(yán)重

6、污染。
　　3.泰安黃前水庫(kù)中產(chǎn)ESBL耐熱腸桿菌的耐藥性及整合子特點(diǎn)
　　我們以產(chǎn)ESBL耐熱大腸菌(extended-spectrumβ-lactamases-producing thermotolerant coliforms,ESBL-TC)為指示菌，對(duì)泰安黃前水庫(kù)中分離的ESBL-TC的耐藥性、bla基因型、整合子(1、2、3類)及基因盒的特點(diǎn)進(jìn)行分析。共分離到96株非重復(fù)性ESBL-TC菌株，ESBL基因包括bl

7、aCTX-M-14(n=47),blaCTX-M-15(n=27),blaCTX-M-55(n=18),blaSHV-12(n=4),blaCTX-M-3(n=3),and blaCTX-M-123(n=1)。其中83株含有1類整合子(86.5％)，2株含有2類整合子，整合子基因盒的大小在0.2 kb至3.2 kb之間。該結(jié)果表明，黃前水庫(kù)已被ESBL-TC嚴(yán)重污染，成為耐藥基因的儲(chǔ)存器。
　　4.泰安健康農(nóng)村居民中糞便攜帶CTX

8、-M型產(chǎn)ESBL腸桿菌的高流行率及風(fēng)險(xiǎn)因素分析
　　為了解泰安地區(qū)農(nóng)村健康居民糞便中CTX-M型ESBL腸桿菌科細(xì)菌的攜帶情況及相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因素。從農(nóng)村居民中共收集620份糞便樣本，篩選CTX-M陽(yáng)性腸桿菌，并應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)方法對(duì)糞便攜帶的相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因素進(jìn)行分析。458株攜帶CTX-M的腸桿菌(458/620，73.9%)分離于不同的人，最主要的基因型為CTX-M-9組(303/458，66.2%)。攜帶CTX-M基因的腸桿菌中，主要為大

9、腸桿菌(403/458，88%)和肺炎克雷伯菌(26、458、5.7%)。所有CTX-M陽(yáng)性菌株都對(duì)氨芐西林、頭孢唑林、頭孢呋辛、頭孢曲松耐藥，但都對(duì)比阿培南、亞胺培南、美羅培南敏感。多變量邏輯回歸模型分析結(jié)果：受正規(guī)教育(OR2.321;95%CI1.302–3.768;P=0.039)，過(guò)去6個(gè)月內(nèi)的住院情況(OR1.753;95% CI1.127–2.584;P=0.031)和過(guò)去6個(gè)月內(nèi)抗生素的使用(OR1.892;95% CI

10、1.242–2.903;P=0.034)，這三個(gè)變量與CTX-M型產(chǎn)ESBL陽(yáng)性菌株攜帶者具有顯著相關(guān)性(x2=21.21;df=3;P＜0.001)。泰安市健康農(nóng)村居民的糞便攜帶CTX-M型產(chǎn)ESBL腸桿菌糞便的流行率高，主要與近期抗生素的使用和住院情況有關(guān)。
　　5.從豬和養(yǎng)殖工作人員分離的產(chǎn)ESBL大腸桿菌的特性
　　食品性動(dòng)物一直被認(rèn)為產(chǎn)ESBL大腸桿菌的存儲(chǔ)器。為分析和比較豬源與豬場(chǎng)工作人員中攜帶的產(chǎn)ESBL大腸桿

11、菌的特點(diǎn)，從4個(gè)育肥豬場(chǎng)中采集60頭豬的肛門棉拭子(15個(gè)樣品/豬場(chǎng))，并采集40個(gè)豬場(chǎng)工作人員的直腸棉拭子(10人/豬場(chǎng))。從以下幾個(gè)方面對(duì)分離的產(chǎn)ESBL大腸桿菌進(jìn)行分析：ESBL基因型，耐藥譜，ERIC和多位點(diǎn)序列分型。自60份豬肛門棉拭子中分離到34株產(chǎn)ESBL陽(yáng)性大腸桿菌，20.0%(8/40份)的工作人員棉拭子為產(chǎn)ESBL大腸桿菌陽(yáng)性。更重要的是，同一豬場(chǎng)內(nèi)豬源和工作人員中分離到的產(chǎn)ESBL大腸桿菌菌株具有相同的β-內(nèi)酰胺酶

12、基因、耐藥譜、ERIC型以及相同的ST型。結(jié)果表明在動(dòng)物與人之間可能存在產(chǎn)ESBL大腸桿菌的傳播。
　　6. ESBLs耐藥質(zhì)粒全序列分析
　　編碼ESBLs基因通常位于質(zhì)粒上，并通過(guò)接合、轉(zhuǎn)座作用轉(zhuǎn)移和傳播。我們挑選了一株水源攜帶CTX-M-15基因的大腸桿菌W121，進(jìn)行體外耐藥質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移，并對(duì)質(zhì)粒DNA全序列分析。攜帶的CTX-M-15耐藥性質(zhì)粒Tp采用鳥(niǎo)槍法構(gòu)建文庫(kù)方法進(jìn)行DNA測(cè)序并利用生物信息學(xué)方法分析了其編碼

13、基因和結(jié)構(gòu)。質(zhì)粒Tp全長(zhǎng)為94495 bp，屬于IncI1質(zhì)粒不相容性分組。質(zhì)粒全序列上共含有116個(gè)預(yù)測(cè)基因，僅攜帶兩個(gè)已知耐藥基因blaCTX-M-15和blaTEM-1。Tp的基本結(jié)構(gòu)與質(zhì)粒R64非常的相似，骨架之間共線性主要位于轉(zhuǎn)移區(qū)域，并且同樣含有大腸桿菌素Ib基因。耐藥質(zhì)粒Tp可看作由轉(zhuǎn)座子Tn3介導(dǎo)的ISEcp1-blaCTX-M-15相關(guān)元件嵌合體。類似Tp質(zhì)粒上兩個(gè)不同β-內(nèi)酰胺酶基因的同時(shí)轉(zhuǎn)座，會(huì)導(dǎo)致耐藥基因的廣泛傳

14、播，具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義，需進(jìn)一步研究。
　　7.水源產(chǎn)ESBL大腸桿菌在小鼠腸道內(nèi)滯留
　　應(yīng)用小鼠腸道定植模型，檢測(cè)水源產(chǎn)ESBL大腸桿菌耐藥基因在體內(nèi)的定植能力以及抗生素對(duì)產(chǎn)ESBL大腸桿菌在腸道內(nèi)滯留的影響。小鼠接觸的飲用水污染濃度越高，耐藥菌在腸道內(nèi)滯留的時(shí)間越長(zhǎng)，但最終會(huì)低于檢測(cè)水平。在抗生素(頭孢菌素)處理的小鼠中，水源大腸桿菌在腸道內(nèi)定植水平為108 cfu/g；未給予抗生素的小鼠中，由于小鼠腸道固有菌群

15、的定植拮抗作用，耐藥菌迅速下降至檢測(cè)限以下，但再給予抗生素治療后，耐藥菌直接達(dá)到可檢測(cè)水平并上升至108 cfu/g糞便。此外，在小鼠腸道內(nèi)定植期間可檢測(cè)到耐藥質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移，blaCTX-M和blaTEM基因可同時(shí)轉(zhuǎn)移至腸道固有腸桿菌中?？傊茨退幋竽c桿菌能夠很好地在腸道內(nèi)定植，攜帶的質(zhì)粒在體內(nèi)具有轉(zhuǎn)移能力。抗生素治療有利于耐藥菌的選擇生長(zhǎng)及腸道內(nèi)的定植，增強(qiáng)了耐藥基因庫(kù)，最終提高了耐藥基因的傳播風(fēng)險(xiǎn)。
　　8.水源產(chǎn)ESBL大腸

16、桿菌耐藥基因在炎癥小鼠腸道內(nèi)的水平轉(zhuǎn)移
　　首先建立小鼠腸道炎癥模型。在沙門氏菌感染的鏈霉素處理小鼠模型中，小鼠腸道炎癥促進(jìn)了供體菌(108-1011 cfu/g糞便)和受體菌(108-1010 cfu/g糞便)在腸道內(nèi)的共同大量增值。在大量增值的狀態(tài)下，檢測(cè)供體菌與受體菌之間質(zhì)粒Tp的轉(zhuǎn)移接合率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接合菌(TCs)幾乎等于受體菌在腸道內(nèi)的水平，且轉(zhuǎn)移率高達(dá)近100%，顯著高于正常腸道組。說(shuō)明在5dpi幾乎所有的受體菌都接受

17、了質(zhì)粒成為TCs。在正常腸道小鼠模型中，由于腸道內(nèi)定植拮抗，供體菌、受體菌的水平顯著低于腸道炎癥組小鼠，接合菌的水平也遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于受體菌?？傊装Y引發(fā)腸道內(nèi)腸桿菌的大量繁殖，使得供體菌和受體菌的密度比正常哺乳動(dòng)物腸道內(nèi)提高了100多倍。這促進(jìn)了不同腸桿菌之間遺傳物質(zhì)的重排和轉(zhuǎn)移，表明感染的病人體內(nèi)更容易發(fā)生質(zhì)粒編碼的耐藥因子的擴(kuò)散轉(zhuǎn)移(如ESBL)。
　　9.水源產(chǎn)ESBL大腸桿菌在小鼠腸道內(nèi)質(zhì)粒水平轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制
　　哺乳動(dòng)

18、物腸道內(nèi)含有大量的微生物菌群，這些微生物菌群可以通過(guò)質(zhì)粒水平轉(zhuǎn)移的方式與入侵微生物之間進(jìn)行基因的交換，導(dǎo)致超級(jí)毒力或耐藥的菌株出現(xiàn)，但至今其轉(zhuǎn)移機(jī)制尚不明確。為了更確切地證明是否在水源大腸桿菌(E.coli W121)與腸道固有大腸桿菌之間發(fā)生了質(zhì)粒水平轉(zhuǎn)移，以及從分子生物學(xué)角度探討其水平轉(zhuǎn)移的機(jī)制。首先利用生物信息學(xué)將Tp質(zhì)粒與固有大腸桿菌(EC615)所接受的質(zhì)粒比較，發(fā)現(xiàn)EC615質(zhì)粒(Tpinv)與Tp質(zhì)粒同源性為＞99%，唯一