CUL4B對(duì)腫瘤誘導(dǎo)的髓系抑制細(xì)胞的調(diào)控作用及其機(jī)制.pdf

1、本文分為以下幾個(gè)部分進(jìn)行探討：
　　第一部分 Cul4b條件性敲除小鼠的建立與表型分析
　　前期研究結(jié)果顯示Cul4b敲除雜合子小鼠宮內(nèi)發(fā)育遲緩是由于胎盤血管發(fā)育異常所致;CUL4B突變的X連鎖精神發(fā)育遲滯綜合征患者表現(xiàn)出單核細(xì)胞增多的表型。這些結(jié)果使我們有理由相信CUL4B在血管新生和血細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用。為驗(yàn)證這一假設(shè)，本部分首先建立并分析了內(nèi)皮細(xì)胞和造血祖細(xì)胞特異性敲除Cul4b基因的Tek-Cre條件性敲除小鼠。

2、
　　1.建立Cul4bflox/Y Tek-Cre+/-條件性敲除小鼠模型:Tek-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠CRE酶的表達(dá)受Tek基因啟動(dòng)子和增強(qiáng)子調(diào)控，Tek基因在內(nèi)皮細(xì)胞和造血祖細(xì)胞中表達(dá)。為獲得組織特異性敲除小鼠，我們將實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的Cul4bflox/flox基因打靶小鼠與Tek-Cre+/-轉(zhuǎn)基因鼠交配，獲得Cul4bflox/Y Te k-Cre+/-條件性敲除小鼠(Cul4bCKO);分別利用免疫組化、Western B

3、lot和實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法證實(shí)Cul4bflox/Y Tek-Cre+/-敲除小鼠的內(nèi)皮細(xì)胞和造血細(xì)胞中CUL4B得到有效敲除。
　　2.Cul4bflox/YTek-Cre+/-小鼠的表型:對(duì)Cul4b CKO小鼠和野生對(duì)照小鼠的主要組織進(jìn)行H&E染色，結(jié)果顯示Cul4b CKO小鼠沒(méi)有明顯的組織學(xué)異常;外周血有核細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)分析未發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞主要亞群在兩種基因型小鼠間的明顯差異，而流式檢測(cè)結(jié)果顯示Cul4b CKO小鼠外周

4、血、脾臟以及骨髓中都有CD11b+Gr-1+細(xì)胞群的累積，未發(fā)現(xiàn)其它成熟的細(xì)胞亞群比例的明顯變化，分析這群細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞增殖的影響發(fā)現(xiàn)這群細(xì)胞獲得了免疫抑制能力。
　　第二部分 宿主造血系統(tǒng)CUL4B缺失促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)并伴隨MDSCs累積與活化
　　1.造血系統(tǒng)中CUL4B缺失促進(jìn)移植瘤生長(zhǎng):向Cul4b CKO小鼠及其對(duì)照小鼠皮下接種B16/F0與EL4移植瘤，結(jié)果顯示CUL4B缺失導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞在Cul4bflox/Y Tek

5、-Cre+/-小鼠體內(nèi)更為迅速地生長(zhǎng)。
　　2.造血系統(tǒng)中CUL4B缺失促進(jìn)MDSCs的累積:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩組荷瘤小鼠外周血、脾臟、骨髓以及腫瘤組織中MDSCs的比例，結(jié)果顯示MDSCs細(xì)胞群在Cul4b CKO小鼠體內(nèi)的累積明顯多于野生對(duì)照小鼠，并且這種累積現(xiàn)象在MDSCs的兩個(gè)亞群中都存在;為了排除Cul4b CKO小鼠體內(nèi)MDSCs累積的增多是腫瘤生長(zhǎng)更速度快帶來(lái)的效應(yīng)，在荷瘤6天時(shí)進(jìn)行上述組織的流式檢測(cè)，結(jié)果顯示在這個(gè)腫

6、瘤生長(zhǎng)沒(méi)有差異的時(shí)間點(diǎn)，MDSCs細(xì)胞群在兩種基因型小鼠中的累積已經(jīng)存在顯著差異，證實(shí)了CUL4B對(duì)MDSCs累積的負(fù)調(diào)控作用。
　　3.CUL4B缺失的MDSCs介導(dǎo)了Cul4b CKO小鼠體內(nèi)腫瘤更快的生長(zhǎng):采用MDSC/EL4腫瘤細(xì)胞混合移植的模型以及骨髓移植模型檢測(cè)了CUL4B缺失導(dǎo)致的移植瘤生長(zhǎng)速度加快是否是MDSCs介導(dǎo)的，結(jié)果顯示混合CUL4B缺失MDSCs的腫瘤細(xì)胞在野生型小鼠體內(nèi)生長(zhǎng)更為迅速;移植了CUL4B缺失

7、MDSCs的受體小鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)更快并伴隨受體小鼠自體MDSCs更快的累積。
　　4.造血系統(tǒng)中CUL4B缺失促進(jìn)機(jī)體的免疫耐受:有報(bào)道稱MDSCs在抑制機(jī)體免疫反應(yīng)的同時(shí)可以抑制機(jī)體的免疫排斥反應(yīng)，促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生免疫耐受。為了檢測(cè)Cul4b基因敲除是否改變機(jī)體的免疫耐受能力，利用BaBL/c小鼠來(lái)源的乳腺癌細(xì)胞系4T1對(duì)兩種基因型小鼠進(jìn)行皮下接種，結(jié)果顯示CUL4B缺失的小鼠可以耐受4T1腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，而野生對(duì)照小鼠完全排斥了異源

8、腫瘤的生長(zhǎng)。
　　5.造血系統(tǒng)中CUL4B缺失增強(qiáng)MDSCs的免疫抑制能力:MDSCs的免疫抑制功能主要表現(xiàn)在對(duì)T細(xì)胞功能的抑制，對(duì)MDSCs免疫抑制能力的檢測(cè)結(jié)果顯示:在體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，CUL4B缺失的MDSCs兩個(gè)亞群對(duì)CD4+或CD8+T細(xì)胞的增殖都有更明顯的抑制作用。在荷瘤小鼠體內(nèi)，Cul4b CKO小鼠腫瘤組織內(nèi)浸潤(rùn)的CD4+和CD8+T細(xì)胞比例都明顯低于野生型，與此一致的是，CUL4B缺失后荷瘤小鼠外周血以及脾臟中T

9、細(xì)胞兩個(gè)亞群的比例也都顯著降低;同時(shí)，CUL4B缺失后MDSCs胞內(nèi)發(fā)揮抑制作用的效應(yīng)分子的表達(dá)水平普遍有所升高，對(duì)應(yīng)的效應(yīng)產(chǎn)物ROS以及NO的釋放也明顯增多，證實(shí)CUL4B對(duì)MDSCs活化的負(fù)調(diào)控作用。
　　6.CUL4B缺失導(dǎo)致MDSCs分化異常:為了探究CUL4B缺失導(dǎo)致MDSCs累積加快的原因，對(duì)MDSCs的增殖和凋亡情況進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)MDSCs的增殖與凋亡在兩種基因型間存在差異;接下來(lái)，檢測(cè)了CUL4B缺失后造

10、血祖細(xì)胞向MDSCs分化的能力，流式檢測(cè)結(jié)果顯示CUL4B缺失的造血祖細(xì)胞分化為MDSCs的比例明顯增多;腫瘤誘導(dǎo)的MDSCs累積常常歸因于其成熟分化的受阻，所以進(jìn)一步對(duì)分離純化的MDSCs進(jìn)行體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，流式檢測(cè)結(jié)果顯示CUL4B缺失的MDSCs向成熟的巨噬細(xì)胞以及樹突細(xì)胞分化的能力明顯減弱。綜合看來(lái)，CUL4B的缺失通過(guò)促進(jìn)造血祖細(xì)胞向MDSCs的分化以及阻礙MDSCs的成熟分化兩方面機(jī)制造成了MDSCs的累積。
　　第三部

11、分 CUL4B通過(guò)正向調(diào)控AKT/β-catenin信號(hào)通路抑制MDSCs的累積與活化
　　1.CUL4B通過(guò)調(diào)控GSK3β介導(dǎo)的β-catenin降解抑制MDSCs的累積:有報(bào)道顯示β-catenin在MDSCs的累積與免疫抑制功能中發(fā)揮重要作用。為探究CUL4B調(diào)控MDSCs的累積和活化過(guò)程是否依賴β-catenin，對(duì)β-catenin的蛋白水平進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示CUL4B缺失后MDSCs胞內(nèi)伴隨著GSK3β活性升高β-e

12、atenin的降解增多，從而導(dǎo)致β-catenin蛋白水平下降，而且這一降解增多的現(xiàn)象可以被GSK3β的抑制劑拯救;利用GSK3β的抑制劑分別對(duì)分離純化后的Lin-造血祖細(xì)胞和MDSCs進(jìn)行體外誘導(dǎo)處理，流式檢測(cè)結(jié)果顯示CUL4B缺失所導(dǎo)致的造血祖細(xì)胞向MDSCs分化增多以及MDSCs進(jìn)一步成熟分化受阻的現(xiàn)象都有所改善;利用β-catenin持續(xù)表達(dá)的慢病毒分別感染分離純化后的Lin-造血祖細(xì)胞和MDSCs后進(jìn)行誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)，也得到了相

13、同的結(jié)果;在體內(nèi)，給小鼠腹腔注射LiCl后，Cul4b CKO小鼠外周血中CD11b+Gr-1+細(xì)胞群的累積明顯緩解，同時(shí)再對(duì)小鼠進(jìn)行荷瘤實(shí)驗(yàn)，CUL4B缺失所引起的腫瘤生長(zhǎng)加快的現(xiàn)象也得到明顯拯救。因此，我們得出結(jié)論CUL4B通過(guò)上調(diào)β-catenin的表達(dá)負(fù)向調(diào)控MDSCs的累積與活化過(guò)程。
　　2.CRL4B協(xié)同PRC2和HDACs轉(zhuǎn)錄抑制磷酸酶PP2A和PHLPP1/2的表達(dá)從而促進(jìn)AKT激酶的活性:為了進(jìn)一步探究CUL4

14、B調(diào)控GSK3β活性的機(jī)制，對(duì)野生以及敲除小鼠來(lái)源的MDSCs中p-GSK3β(Ser9)的激酶AKT的活性進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)代表AKT活性的Thr308和Ser473兩個(gè)位點(diǎn)的磷酸化水平在CUL4B缺失之后都有不同程度地降低，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)位點(diǎn)磷酸化水平的降低是它們對(duì)應(yīng)的磷酸酶PP2A以及PHLPP1/2表達(dá)水平的升高引起的。通過(guò)ChIP實(shí)驗(yàn)，證實(shí)CRL4B、PRC2和HDACs復(fù)合物的主要成分共同結(jié)合于PP2A以及PHLPP

15、1/2對(duì)應(yīng)基因的啟動(dòng)子區(qū)域，q-ChiP結(jié)果顯示在CUL4B低表達(dá)的RAW264.7細(xì)胞中H2AK119的單泛素化水平明顯降低，PRC2的主要組分EZH2和HDACs在這幾個(gè)磷酸酶基因啟動(dòng)子上的結(jié)合也明顯減少，同時(shí)伴有它們的底物H3K27三甲基化水平的降低以及組蛋白的乙?；降拿黠@升高，說(shuō)明CUL4B對(duì)這些磷酸酶基因具有明顯的轉(zhuǎn)錄抑制作用。
　　3.MDSCs的累積和活化與CUL4B/AKT/β-catenin信號(hào)通路呈負(fù)相關(guān)性

16、:上述實(shí)驗(yàn)顯示CUL4B缺失后引起的MDSCs中AKT/β-catennin信號(hào)通路的下調(diào)并且導(dǎo)致MDSCs的累積與活化，那么這種負(fù)調(diào)控關(guān)系在野生型MDSCs中是否也存在呢？分別在未免疫以及荷瘤小鼠來(lái)源的MDSCs中檢測(cè)CUL4B、PHLPP1/2、PP2A、AKT、GSK3β以及β-catenin的表達(dá)情況，結(jié)果顯示在活化的MDSCs中，這些分子的表達(dá)水平與CUL4B缺失所導(dǎo)致的信號(hào)途徑的改變結(jié)果一致，同時(shí)伴隨著CUL4B表達(dá)的下調(diào)。

17、與此相一致，癌癥患者M(jìn)DSCs中CUL4B/AKT/β-catenin信號(hào)也呈現(xiàn)一個(gè)顯著低于健康對(duì)照的狀態(tài)，表明伴隨著腫瘤進(jìn)程的發(fā)展，CUL4B/AKT/β-catenin信號(hào)通路在MDSCs中表達(dá)普遍下調(diào)。
　　綜上，CUL4B可以限制免疫抑制腫瘤微環(huán)境的重要組分MDSCs的累積與活化，因而CUL4B的缺失促進(jìn)了Cul4b CKO小鼠體內(nèi)移植瘤生長(zhǎng)速度的加快以及其機(jī)體免疫耐受能力的增強(qiáng);機(jī)制上，CUL4B通過(guò)協(xié)同轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物P

18、RC2和HDACs抑制磷酸酶PP2A和PHLPP1/2的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)AKT激酶的活性，下調(diào)GSK3β介導(dǎo)的β-catenin蛋白降解，從而負(fù)向調(diào)控MDSCs的異常累積;此外，相對(duì)比其它造血細(xì)胞，健康個(gè)體的MDSCs中CUL4B/AKT/β-catenin信號(hào)途徑的表達(dá)下調(diào)，而這下調(diào)一現(xiàn)象在荷瘤小鼠和腫瘤患者中更為顯著。因此，我們得出結(jié)論，雖然CUL4B在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮原癌基因的作用，但是在免疫抑制腫瘤微環(huán)境的形成中它卻發(fā)揮負(fù)調(diào)控因子的