Tfh細胞調(diào)控B細胞分化及其對移植排斥反應(yīng)作用的機制研究.pdf

1、在我們?nèi)祟愘囈陨娴耐猸h(huán)境中，存在著大量對人類有害的微生物，如病毒、細菌、真菌、寄生蟲及原生動物等，而當上述微生物入侵人體，這些外源生物性刺激將會引起機體免疫性應(yīng)答。而機體的免疫系統(tǒng)能夠識別外來入侵的關(guān)鍵是它可以識別這些微生物上的特異性標志——抗原。而器官移植，一項發(fā)展不過百年卻又作為當今治療臟器終末期疾病的主要方法之一，也會將移植物上的外來性抗原帶入受者體內(nèi)，而受者的免疫系統(tǒng)通過對這些外來性抗原的識別，會產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答，即移植排

2、斥反應(yīng)。
　　經(jīng)過數(shù)十年的研究，移植排斥反應(yīng)被分為了兩大種類，即細胞性排斥反應(yīng)及體液性排斥反應(yīng)。細胞性排斥反應(yīng)常見于在急性排斥反應(yīng)中，是機體在在移植物外來抗原的刺激下，T淋巴細胞識別抗原而大量激活、合并IL-2等促炎性細胞因子的生成增加，激活的T細胞大量增殖，引起了以T細胞為主的對移植物的排斥反應(yīng)。當供體器官經(jīng)移植手術(shù)植入受者體內(nèi)，由于供體和受者之間的組織相容性抗原(MHC)的不同，受體外周循環(huán)中的T淋巴細胞識別移植物的抗原而獲得

3、第一信號激活，隨后進入附近的外周免疫器官（脾臟或淋巴結(jié)）中，一部分轉(zhuǎn)化形成淋巴母細胞，并迅速增殖分化為具有活性可識別抗原的致敏性T淋巴細胞。其中CD8+細胞毒性T淋巴細胞可以通過識別抗原引起細胞溶解直接對移植物造成損傷，而CD4+T輔助細胞則可以合成釋放多種細胞因子(IL-2、IL-6、IFN-γ)等，通過具有直接殺傷作用的亞群直接或通過輔助CD8+T細胞、自然殺傷細胞和B淋巴細胞等間接作用于移植物造成損傷。而體液性排斥反應(yīng)則是由B淋巴

4、細胞介導(dǎo)（或DC識別抗原啟動），首先B細胞經(jīng)BCR(B cell receptor，BCR)特異性識別移植物表面抗原，激活第一信號;激活B細胞的第二信號即協(xié)同刺激信號則是由T輔助細胞與B細胞相互作用所提供的。激活的的B細胞隨后進入生發(fā)中心，在T輔助細胞的協(xié)助下經(jīng)過一系列分化過程形成漿細胞或記憶性B細胞，并通過漿細胞產(chǎn)生大量高親和力抗體對移植物產(chǎn)生殺傷作用。
　　傳統(tǒng)免疫學的經(jīng)典理論認為，針對TD抗原的抗體免疫應(yīng)答是需要CD4+T細

5、胞的輔助。CD4+T細胞在B細胞活化及體液免疫中發(fā)揮了十分重要的作用，傳統(tǒng)理論認為，Th2細胞通過CD40/CD40L、CD28/B7與B細胞相互作用，并通過分泌IL-4、IL-2等來發(fā)揮輔助B細胞活化的作用。但B細胞活化后在外周免疫器官的生發(fā)中心中須經(jīng)過體細胞突變、親和力成熟、受體編輯和類型轉(zhuǎn)換等過程，這些過程是否需要T細胞的輔助以及如何輔助或調(diào)控的機制尚沒有研究透徹。通過近年的研究，濾泡輔助性T細胞(Follicular helpe

6、r T cells，Tfh)亞群作為在生發(fā)中心內(nèi)真正輔助B細胞分化的功能已得到了驗證，而Tfh自身的分化過程也有了一定了解，但Tfh細胞輔助B細胞的機制并未完全揭示。目前研究顯示，IL-21敲除小鼠出現(xiàn)Tfh細胞分化障礙，并影響了進一步的GC形成及抗體生成，因此，IL-21是Tfh細胞分化過程中的必須因子之一。針對Tfh分化過程中的此特點，我們希望通過以Tfh為靶點，通過阻斷IL-21通路抑制體液性排斥反應(yīng)，從而保護達到移植物的作用。<

7、br>　　一、Tfh細胞調(diào)控B細胞分化的機制
　　在第一部分中，我們首先通過提取小鼠脾臟T細胞并應(yīng)用IL-21對其進行刺激，通過蛋白印跡檢測，IL-21可以明顯活化T細胞內(nèi)的STAT3通路，證明IL-21在小鼠脾臟內(nèi)是通過活化T細胞內(nèi)STAT3通路提供給T細胞向Tfh細胞分化的信號。進一步研究我們希望通過IL-21R-Fc阻斷IL-21對T細胞的刺激作用，因此我們先用IL-21R-Fc對T細胞進行預(yù)處理，再進一步使用IL-21對其

8、進行刺激，結(jié)果表明，在IL-21R-Fc濃度為10ng/ml時可完全阻斷IL-21對T細胞內(nèi)STAT3的激活。進一步研究我們通過小鼠體液性免疫（SRBC免疫）模型，研究使用IL-21R-Fc阻斷IL-21信號通路后，對Tfh細胞分化的影響。在對不同處理的小鼠使用SRBC免疫后7天，首先對外周血中成熟B細胞的比例進行檢測，結(jié)果無明顯差異，證明IL-21-Fc并未對B細胞在骨髓中的分化產(chǎn)生影響;通過檢測小鼠脾臟中Tfh細胞分化結(jié)果顯示，IL

9、-21R-Fc明顯抑制了SRBC免疫后的Tfh細胞分化;通過對脾臟內(nèi)生發(fā)中心的分析顯示，Tfh細胞分化收到抑制后，生發(fā)中心的形成明顯降低;對邊緣區(qū)B細胞及濾泡B細胞的分析發(fā)現(xiàn)，濾泡B細胞的數(shù)量在IL-21R-Fc處理后大大減少，證明SRBC免疫后的反應(yīng)為特異性體液免疫反應(yīng)，且此反應(yīng)收到了抑制;對外周血中的漿細胞及抗體量進行分析發(fā)現(xiàn)，IL-21R-Fc處理后漿細胞數(shù)量及抗體滴度都大大降低，直接證明了IL-21R-Fc對體液性免疫反應(yīng)的抑制

10、作用。
　　二、Tfh細胞調(diào)控體液性排斥反應(yīng)的作用及機制
　　通過第一部分的實驗，證明了IL-21R-Fc對Tfh細胞分化的抑制作用，因此，第二部分的實驗我們使用IL-21R-Fc處理受體小鼠并進行心臟異位移植。在小鼠心臟移植后的急性排斥反應(yīng)中，我們通過受體的血清漿細胞數(shù)量及抗體滴度的增加、移植物的IgG及C4d沉積程度增加，證明小鼠心臟移植后的急性排斥反應(yīng)有體液免疫的參加。而通過進一步實驗使用IL-21R-Fc處理后的小鼠

11、移植物生存期延長;移植物的心肌排列相對較好，心肌細胞水腫壞死減輕，炎癥細胞浸潤明顯降低，血管內(nèi)皮細胞腫脹程度較輕，炎癥細胞浸潤降低，證明其組織損傷降低;TUNEL結(jié)果IL-21R-Fc處理使心肌細胞的凋亡也有所降低;而通過體液性排斥反應(yīng)診斷的金標準C4d的檢測也明確表明IL-21R-Fc處理后的移植物內(nèi)C4d的浸潤明顯降低;通過對受體外周血的檢測，其血漿內(nèi)漿細胞數(shù)量及抗體滴度也明顯降低。所有的結(jié)果都證明，IL-21R-Fc對小鼠心臟移植

12、后的體液排斥反應(yīng)具有抑制作用。
　　進一步我們對移植后受體的脾臟進行流式分析發(fā)現(xiàn)，IL-21R-Fc處理后小鼠移植后脾臟內(nèi)Tfh細胞數(shù)量明顯降低，生發(fā)中心的形成也受到了抑制。這與第一部分的結(jié)果相符合，證明了IL-21R-Fc在心臟移植中也可以移植Tfh細胞的分化。
　　綜上所述，我們首先通過IL-21刺激小鼠脾臟T細胞證明了其通過激活STAT3通路作用，而IL-21R-Fc可以阻斷這種作用;利用小鼠體液免疫模型，我們證明了I