骨髓髓系細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧分子對急性粒系造血的調(diào)控及其機(jī)制的研究.pdf

1、研究目的:中性粒細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成成分，對人體防御細(xì)菌、真菌等病原物的入侵發(fā)揮著不可替代的作用。在感染和炎癥情況下大量的中性粒細(xì)胞會從外周血和骨髓的貯存池中被募集到受累的組織部位，通過吞噬、活性氧分子(ROS)和顆粒酶等方式殺滅和消除入侵的病原物質(zhì)，并引發(fā)自身的凋亡或其他形式的死亡;這一過程會導(dǎo)致中性粒細(xì)胞的大量消耗，并促使機(jī)體在骨髓中啟動急性粒系造血來補(bǔ)償損失掉的中性粒細(xì)胞，以維持體內(nèi)的粒細(xì)胞的平衡。然而，至今調(diào)控急性粒系造

2、血的分子機(jī)制還不是十分清楚。早期的研究表明粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞單核細(xì)胞集落刺激因子(GM-C SF)、白細(xì)胞介素3（IL-3）、白細(xì)胞介素6(IL-6)等均可以調(diào)控粒系造血的發(fā)生過程，但敲除其中的一個(gè)基因或者聯(lián)合敲除兩個(gè)或三個(gè)基因的小鼠依然能夠進(jìn)行正常造血和急性粒系造血;這提示我們在已知的調(diào)控因子之外還存在其他的因子能夠調(diào)控粒系造血的過程。活性氧分子可參與造血過程的調(diào)控，低氧環(huán)境有利于造血干細(xì)胞保持干性，而高氧環(huán)境下

3、造血干細(xì)胞干性減低、分化增多。我們在研究中發(fā)現(xiàn)在急性炎癥/感染條件下小鼠骨髓中的活性氧水平升高了，但骨髓中活性氧分子是否參與急性粒系造血的調(diào)控還不得而知，為此，我們開展了相關(guān)試驗(yàn)研究，以期揭示其中的關(guān)聯(lián)性和可能潛在的調(diào)控機(jī)理。
　　研究方法:給小鼠腹腔注射硫膠質(zhì)或滅活的大腸桿菌，建立急性炎癥期的小鼠模型，采用熒光探針法檢測骨髓內(nèi)活性氧的含量，采用流式細(xì)胞分析術(shù)、BrdU摻入法和造血干祖細(xì)胞集落培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)分析小鼠骨髓造血干祖細(xì)胞的數(shù)目

4、及增殖水平，應(yīng)用活性氧抑制劑或激動劑探究活性氧分子與急性粒系造血的關(guān)系，應(yīng)用基因缺陷小鼠（CGD小鼠）及骨髓造血干祖細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)分析活性氧分子的來源和作用途徑，應(yīng)用Western Blot技術(shù)分析活性氧的作用靶分子及作用機(jī)制。
　　研究結(jié)果:我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:
　　1)給小鼠腹腔注射硫膠質(zhì)或滅活的大腸桿菌24小時(shí)后，小鼠骨髓、外周血中性粒細(xì)胞數(shù)目增多（骨髓內(nèi)由4.2±0.4增長到7.5±0.5×106/股骨），骨髓內(nèi)粒系造

5、血祖細(xì)胞增殖水平增高(BrdU摻入陽性率均值由34％增高到54％)，體外培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞形成粒系集落的數(shù)目增多、直徑增大（集落數(shù)目由42/10000增大至64/10000），即我們成功的建立了發(fā)生急性粒系造血的小鼠模型;
　　2)急性炎癥狀態(tài)下的小鼠骨髓環(huán)境中活性氧分子含量比正常對照小鼠的增高了3-10倍，抑制或促進(jìn)活性氧的產(chǎn)生分別能夠抑制和促進(jìn)粒系祖細(xì)胞的增殖、G-CFU和GM-CFU的增多增大、BrdU摻入率的升高;
　　

6、3) CGD小鼠NOX2（NADPH氧化酶2）功能缺陷，受炎癥因子刺激時(shí)骨髓內(nèi)吞噬細(xì)胞不能產(chǎn)生活性氧分子(NOX2依賴性的)，急性炎癥狀態(tài)下CGD小鼠的粒系造血祖細(xì)胞增殖率未明顯升高，移植實(shí)驗(yàn)中受者CGD小鼠體內(nèi)的供者(Wild Type)來源的正常造血祖細(xì)胞也未見增殖率升高，說明這些活性氧分子主要是由中性粒細(xì)胞通過NOX2蛋白體產(chǎn)生的，髓系細(xì)胞(Gr1+)規(guī)則的分布在骨髓組織內(nèi)，其釋放的活性氧通過旁分泌形式作用至祖細(xì)胞而啟動胞內(nèi)增殖信

7、號;
　　4)活性氧分子進(jìn)入粒系造血祖細(xì)胞內(nèi)可以氧化PTEN蛋白而導(dǎo)致其磷酸酶活性減低或失去活性，進(jìn)而引起PtdIns(3，4，5)P3的信號增強(qiáng)，PtdIns(3，4，5)P3的增多又導(dǎo)致磷酸化的Akt增多，所以活性氧是通過PTEN-PtdIns(3，4，5)P3-Akt信號通路促進(jìn)了急性粒系造血的發(fā)生。
　　研究結(jié)論:綜上所述，我們的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，在滅活的大腸桿菌和無菌性硫膠質(zhì)引起的急性腹腔炎癥情況下，小鼠骨髓內(nèi)的中