Sorafenib對急性髓系白血病細(xì)胞體外抑制效應(yīng)及作用機制的初步探討.pdf

1、急性髓系白血病是由于造血干、祖細(xì)胞發(fā)生惡變，失去進一步分化、成熟的能力，使細(xì)胞停滯在不同的造血階段，從而導(dǎo)致的一組異質(zhì)性造血系統(tǒng)惡性腫瘤。目前，已知AML發(fā)病機制中起主要作用的因素包括造血調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子異常所引起的分化障礙以及造血生長因子受體如受體酪氨酸激酶等異常引起的增殖過度，這兩方面的突變合并作用形成的“二次打擊”已成為AML的主要發(fā)病機制。 靶向治療尚無統(tǒng)一和公認(rèn)的定義。廣義地說，凡是針對疾病發(fā)病機制中某一環(huán)節(jié)(靶點)，應(yīng)用

2、相應(yīng)的藥物治療有效的方法，都可稱為靶向治療或靶向療法。 索拉非尼是全球首個口服的Raf激酶抑制劑。此外，作為一個多靶點藥物，索拉非尼同時具有針對包括VEGFR與PDGFR的廣泛酪氨酸激酶受體抑制功能。Raf激酶及其介導(dǎo)的Raf/MEK/ERK通路在腫瘤進展及轉(zhuǎn)移過程中具顯著作用，且與諸多生長因子包括EGFR、VEGF及血小板衍生生長因子(PDGF)等密切相關(guān)。 隨著檢測技術(shù)的不斷完善，近30年來在許多急性髓系白血病患者中

3、發(fā)現(xiàn)的伴有影響髓系成熟和增殖等細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑的重現(xiàn)性遺傳學(xué)異常。目前美國FDA已經(jīng)批準(zhǔn)索拉非尼用于治療晚期腎癌。另外，該藥物在針對黑色素瘤、肝癌、胰腺癌以及非小細(xì)胞肺癌的臨床研究中也已經(jīng)顯示出一定的療效。但將該藥用于急性髓系白血病還未見報道。本實驗的前序?qū)嶒炓堰\用基因芯片檢測出急性髓系白血病細(xì)胞在該藥作用下，部分基因的表達有明顯的改變，如：P53，CCND1，NQ01，CAV1。P53是基因研究最為廣泛深入的腫瘤基因之一，參與細(xì)胞周期

4、的調(diào)節(jié)、DNA修復(fù)、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、血管生產(chǎn)等重要的生物學(xué)功能。CCND1可使細(xì)胞G1期縮短，引起細(xì)胞增殖周期失調(diào)，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。 NQ01可使氫醌所致的細(xì)胞毒性及細(xì)胞凋亡減少;并且骨髓中氫醌和其他苯代謝產(chǎn)物是通過抗氧化成分誘導(dǎo)NQ01，而NQ01可保護細(xì)胞對抗活性氧及其他氧化應(yīng)激形成所致的損害作用．CAV1有抑制GTP酶活性的作用，多種蛋白可與CAV1或酪氨酸磷酸CAV1(pY14)相互作用。能夠完全抑制癌癥表型，意味著不

5、僅能夠抑制腫瘤，而且能夠抑制CCND1誘發(fā)的前癌階段，Cav-1將是發(fā)展抑制CCND1活性的候選藥物靶標(biāo)。 研究目的： 本文旨在研究多靶點藥物索拉菲尼在體外對急性髓系白血病細(xì)胞的抑制作用，初步探討其作用的發(fā)生機制。 材料和方法： 我們的實驗對象包括急性髓系白血病細(xì)胞株HL60，U937，K562；HL60細(xì)胞株，U937細(xì)胞株和K562細(xì)胞株分別作為急性早幼粒白血病(M3)，急性單核白血病(M5)和紅白血

6、病(M6)的模型。急性部分分化型原粒細(xì)胞白血病難治性患者骨髓標(biāo)本1份。正常骨髓標(biāo)本1份。 1、急性髓系白血病細(xì)胞的收集及培養(yǎng) 經(jīng)患者同意后在無菌條件下抽取骨髓標(biāo)本3毫升，常規(guī)抗凝，用淋巴細(xì)胞分離液，密度梯度離心法分離獲得單個核細(xì)胞。按細(xì)胞密度為105/ml-106/ml接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，使用RPMI1640培養(yǎng)液(10％的小牛血清)，37℃，5％C02培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，4小時后吸出非貼壁細(xì)胞重新接種培養(yǎng)，到細(xì)胞對

7、數(shù)生長期開始行下一步處理。正常骨髓單個核細(xì)胞分離及培養(yǎng)同上。 細(xì)胞株直接按照細(xì)胞密度105/ml-106/ml接種于培養(yǎng)瓶中，余同上。每日觀察細(xì)胞生長情況。 2、運用MTT法測定Sorafenib對急性髓系白血病細(xì)胞的IC50 以U937為例，MTT法測定細(xì)胞毒效應(yīng)，酶標(biāo)儀上檢測570nm波長處的吸光度(A值)，計算細(xì)胞殺傷活性。抑制率=1-實驗組A值/陰性對照組A值。 lgIC50=Xm-I(P-(3-

8、Pm-Pn)/4) Xm：lg最大劑量I：lg(最大劑量/相臨劑量) P：陽性反應(yīng)率之和Pm：最大抑制率Pn：最小抑制率。從而得出Sorafenib的IC50。 3、流式細(xì)胞術(shù)測定急性髓系白血病細(xì)胞凋亡率 將培養(yǎng)后達到對數(shù)生長期的六孔板的細(xì)胞分成實驗組和對照組，對照組僅加入溶劑DMSO，而實驗組根據(jù)IC50加入Sorafenib和DMSO。收集加藥培養(yǎng)后0h，6h，24h，48h的細(xì)胞，使甩AnnexinV-FITC試劑

9、盒，流式細(xì)胞術(shù)檢測實驗組及對照組各個時間點的細(xì)胞凋亡率。 4、運用實時定量PCR(SYBR Green I熒光染料法)測定實驗組和對照組在0h和實驗組凋亡率為20％-30％的時間點CAV1、CCND1、TP53、NQQ1等基因的表達量 4.1 Trizle法提取實驗組和對照組在0h和實驗組凋亡率為20％-30％的時間點細(xì)胞的RNA，先后用RNA提取液、氯仿、異丙醇、75％乙醇，分離沉淀洗滌。后RNA沉淀，用適量DEPC處

10、理的無菌去離子水溶解。 4.2運用分光光度計測定提取的RNA的濃度及純度(A260/A280≥1.8)； 4.3逆轉(zhuǎn)錄，10 μl反應(yīng)體系可容納500ng的total RNA。反應(yīng)條件：反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)37℃15min，反轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)85℃，5sec。 4.4引物根據(jù)文獻資料，然后經(jīng)過Primer 5.0軟件改進設(shè)計，日本TAKARA 公司DNA/RNA合成儀合成，合成物用OPC柱純化，于紫外分光光度分析儀定量，分裝

11、凍干后保存于-20℃。 4.5 Real Time PCR反應(yīng)：20μl反應(yīng)體系，應(yīng)用ABI PRISM 7000行定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)Real Time PCR的擴增曲線和溶解曲線。梯度稀釋模板制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 結(jié)果： 1.以U937為例，顯示細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果 倒置熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞生長密度達對數(shù)生長期和加藥后實驗組及對照組6，24，48小時的細(xì)胞生長情況。正常骨髓單個核細(xì)胞如白血病細(xì)胞同培養(yǎng)方

12、法，在培養(yǎng)的第4，5天左右基本都死亡，培養(yǎng)瓶上方漂浮著大量細(xì)胞碎片。 2.MTT法測得Sorafenib對AML的IC50 查文獻得Sorafenib在體外作用于腎癌細(xì)胞的濃度30ug/ml，mtt法是設(shè)置的濃度梯度為0 ug/ml，20 ug/ml，40 ug/ml，60 ug/ml，80 ug/ml，100 ug/ml，120 ug/ml，140 ug/ml，測得IC50為80ug/ml，一般取IC50的1/2-1/

13、3，避免凋亡所致的死亡率過高。所以實驗組設(shè)置的藥物濃度為25ug/ml． 3.凋亡率的檢測 實驗組和對照組分別用流式細(xì)胞儀檢測各個時間點的凋亡率，實驗組在每個時間點的凋亡率都比對照組高。且隨著時間的推移，凋亡率逐漸升高。24小時凋亡率實驗組凋亡率在20％-30％。 4.RNA的檢測：分光光度計測得所提取的RNA的純度符合要求。 (純度：0D260/0D280=1.8-2.2) 5.Real Time P

14、CR結(jié)果：實驗組和對照組在0h和實驗組凋亡率為20％-30％的時間點CAV1、CCND1、rp53、NQQ1擴增曲線的CT值，通過公式對各個基因相對定量。 結(jié)論： 1、通過流式細(xì)胞儀對實驗組及對照組凋亡率的測定，發(fā)現(xiàn)Sorafenib在體外對急性髓系白血病細(xì)胞有明顯的抑制作用(P(0.05)。 2、Sorafenib作用于急性髓系白血病細(xì)胞后，CAV1、CCND1、TP53、NQ01表達有明顯改變，CAV1、TP