人脂肪來源干細(xì)胞裸鼠皮下移植的實(shí)驗(yàn)性研究.pdf

1、目的： 1．分離和培養(yǎng)人脂肪來源干細(xì)胞(hADSCs)，對hADSCs的干細(xì)胞特性進(jìn)行鑒定。 2．將表達(dá)pEGFP-N3的hADSCs進(jìn)行裸鼠皮下注射移植，觀察細(xì)胞的存活和轉(zhuǎn)歸。 材料和方法： 人脂肪組織取材，酶消化法分離培養(yǎng)hADSCs。觀察細(xì)胞形態(tài)。以成脂和成骨誘導(dǎo)液連續(xù)培養(yǎng)hADSCs 3周后，分別進(jìn)行油紅染色和鈣鹽染色，觀察細(xì)胞多向分化能力。分別于原代和第3代用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞表面分化抗原

2、CD45、CD34、CD133檢測，觀察細(xì)胞不同階段的表型特征。hADSCs體外培養(yǎng)后，以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染pEGFP-N3質(zhì)粒，經(jīng)G418篩選，獲得高陽性率的細(xì)胞。將篩選后的細(xì)胞以注射方式植入裸鼠皮下組織中。分別于8周和12周取材，利用活體化學(xué)發(fā)光和熒光成像系統(tǒng)進(jìn)行活體熒光觀察，組織切片觀察，確定hADSCs植入裸鼠皮下后的存活情況與轉(zhuǎn)歸。 結(jié)果： 1．利用膠原酶消化法，膠原酶/脂肪比3：1、膠原酶濃度1mg/ml、消化時(shí)間

3、1h，可以獲得大量hADSCs。體外培養(yǎng)的人ADSC細(xì)胞為成纖維細(xì)胞樣。 2．hADSCs在成脂和成骨誘導(dǎo)液作用下，可以分別向脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化，表現(xiàn)為油紅染色和鈣鹽染色陽性。 3．在新鮮分離的細(xì)胞中有大量CD45+CD34+細(xì)胞(37.62％)和CD45·CD34+細(xì)胞(24.22％)；原代細(xì)胞中，CD34+CD45-細(xì)胞占大多數(shù)(58.76％)，未見CD45+細(xì)胞和CD133+細(xì)胞。培養(yǎng)3代后，CD34+CD45

4、-細(xì)胞比例降低(30.47％)，CD45+細(xì)胞僅見少量，未見CD133+細(xì)胞。 4.pEGFP-N3質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物轉(zhuǎn)化脂肪來源干細(xì)胞24h后，大量細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白，綠色熒光蛋白陽性細(xì)胞率達(dá)(13.0±3.5)％。以適宜濃度G418篩選后，綠色熒光蛋白陽性細(xì)胞率達(dá)(65.0±5.4)％。 5．以注射方式將pEGFP-N3轉(zhuǎn)染后的hADSCs植入裸鼠皮下組織中，8w和12w后，大體標(biāo)本可見植入?yún)^(qū)周圍分布熒光陽性區(qū)；熒

5、光鏡下可見皮下組織中分布熒光陽性細(xì)胞，對應(yīng)光鏡下皮下組織中未見熒光陽性結(jié)構(gòu)。 結(jié)論： 1．脂肪組織中可以分離獲得大量可貼壁生長的細(xì)胞，其具有多向分化能力，并具有與干細(xì)胞相同的表型特點(diǎn)，即CD34+CD45-CD133-。 2．以脂質(zhì)體法可以將pEGFP-N3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入hADSCs，G418篩選后陽性率明顯提高。 3．hADSCs裸鼠皮下移植后可以向脂肪細(xì)胞分化，hADSCs可作為脂肪組織工程的種子細(xì)胞。