高脂血癥相關性急性胰腺炎的比較蛋白質組學研究.pdf

1、本研究分為以下二部分： 一、高脂血癥對胰腺組織損傷機制的蛋白質組學分析 目的：隨著生活水平的提高，臨床上，高脂血癥的發(fā)病率日趨增多。甘油三酯在脂蛋白脂酶的作用下水解成游離脂肪酸(FFA)，后者進入細胞內進行氧化代謝供應能量或儲存在脂肪內。當體內游離脂肪酸水平增高，超過脂肪組織的儲存能力和各組織對游離脂肪酸的氧化能力，在器官組織產生脂毒性。長期暴露于游離脂肪酸中易損害胰島β細胞釋放胰島素的功能，并誘導β細胞凋亡，與急性胰腺

2、炎、慢性胰腺炎、非胰島素依賴性糖尿病等疾病關系密切。本研究以大鼠為實驗動物，誘導大鼠高甘油三酯血癥模型，從高脂血癥胰腺組織的蛋白質組著手，利用相差凝膠電泳質譜技術，尋找高脂血癥狀態(tài)下胰腺組織的差異表達蛋白，并對這些差異表達蛋白分子進一步深入研究，以期豐富和完善高脂血癥狀態(tài)下胰腺組織損傷的病理生理變化的分子機制。 方法：采用斷乳一周雄性SD大鼠，隨機分成二組，每組5只。其中一組為高脂血癥組，飼以高脂飲食，對照組飼以普通飼料。試驗6

3、周后處死動物，取胰腺組織，裂解提取蛋白質。對胰腺組織進行相差凝膠電泳(DIGE)，應用DeCyder6.5圖像分析軟件將高脂血癥組和正常組胰腺組織膠圖進行匹配，不同膠匹配點相對含量差異有統(tǒng)計學意義的點為差異蛋白質點。對差異蛋白質進行膠內消化、MALDI-TOF-TOF二級質譜鑒定和數(shù)據庫搜索確定差異蛋白質。采用Western印跡法驗證部分差異明顯蛋白質表達情況。 結果：高脂血癥大鼠胰腺組織病理學可見腺泡內散在的脂肪空泡沉積。胰腺

4、組織相差凝膠電泳重復性滿意，顯示的蛋白質斑點在分布、背景等方面基本一致。通過DeCyder6.5圖像分析軟件將高脂血癥組和正常組胰腺組織膠圖進行匹配，高脂血癥組胰腺組織與正常胰腺組織相比，上調蛋白質3種，下調蛋白質11種。其中上調蛋白質為：精氨酸酶Ⅱ、甘氨酸脒基轉移酶和核糖核酸酶抑制劑，高脂血癥組上述蛋白質的含量較正常組分別上調2.19倍、1.82倍和1.12倍；下調蛋白質包括酪氨酰tRNA合成酶、α-淀粉酶、脂肪酶、DJ-1蛋白和Cu

5、、Zn超氧化物歧化酶等，高脂血癥組較正常組分別下調2.48倍、2.37倍、1.85倍、1.73倍和1.65倍。采用方差分析，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。這些蛋白質在胰腺組織中主要與脂肪消化、細胞能量代謝、氧化應激、膠原合成、細胞增殖與分化等相關。Western印跡法證實高脂血癥組大鼠胰腺組織精氨酸酶Ⅱ表達較正常胰腺組織明顯增強，α-淀粉酶表達較正常胰腺組織明顯減弱。 結論：成功構建高脂血癥大鼠模型。利用蛋白質組學技術，從整體

6、角度將蛋白質變化綜合在一起，得到高脂血癥大鼠胰腺組織的蛋白質組特征性變化。在高脂血癥大鼠的胰腺病理生理改變中，差異表達的蛋白質可能通過脂肪消化、細胞能量代謝、氧化應激、膠原合成、細胞增殖與分化等途徑對胰腺組織造成損傷，這些蛋白質的改變可能成為高甘油三酯對胰腺損傷的早期預警標志。 二、高脂血癥合并急性胰腺炎的胰腺組織蛋白質組學分析 目的：急性胰腺炎在臨床發(fā)病率日漸增高，高脂血癥是繼膽源性和酒精源性之后急性胰腺炎的又一重要病

7、因，脂質毒性不僅是作為急性胰腺炎的病因，而且能進一步加重急性胰腺炎的病情。本實驗通過高脂血癥大鼠為實驗動物，誘導高脂血癥大鼠合并急性水腫性胰腺炎和高脂血癥合并急性壞死性胰腺炎動物模型，利用雙向凝膠電泳質譜技術，尋找高脂血癥合并急性胰腺炎狀態(tài)下胰腺組織的差異表達蛋白，并對這些差異表達蛋白分子進一步深入研究，以探討高脂血癥加重急性胰腺炎的胰腺組織病理生理變化的分子機制。 方法：采用斷乳一周雄性SD大鼠，隨機分成二組，每組10只。其中

8、一組為高脂血癥組，飼以高脂飲食，對照組飼以普通飼料。試驗6周后高脂組和對照組均分別予雨蛙肽腹腔內注射和牛磺膽酸鈉胰管內注射，分別建立急性水腫性胰腺炎和急性壞死性胰腺炎模型，造模后9h處死動物，取胰腺組織，裂解提取蛋白質。采用相差凝膠電泳(DIGE)，檢測高脂血癥合并急性胰腺炎組與對照組的蛋白質差異。采用免疫組化驗證差異明顯的蛋白質表達情況。 結果：高脂血癥合并急性水腫性胰腺炎和高脂血癥合并急性壞死性胰腺炎動物模型胰腺組織有典型組

9、織病理學改變。通過DeCyder6.5圖像分析軟件進行匹配，高脂血癥急性壞死性胰腺炎組與正常血脂急性壞死性胰腺炎組分析到59個差異點，39個差異點經質譜成功鑒定，23個點在高脂血癥急性壞死性胰腺炎組上調，16個點下調。高脂血癥急性水腫性胰腺炎組與正常血脂急性水腫性胰腺炎組分析到12個差異點，7個差異點經質譜成功鑒定，2個點在高脂血癥急性水腫性胰腺炎組上調，5個點下調。差異蛋白質主要包括代謝酶類(脂肪酶、淀粉酶、水解碳水化合物的羧基多肽酶

10、、α1抗胰蛋白酶)，內質網應激和鈣代謝相關蛋白質(GRP78、HSP60、蛋白二硫鍵異構酶、鈣網蛋白、膜聯(lián)蛋白)，以及與DNA損傷修復、細胞凋亡、循環(huán)障礙、信號傳導通路等相關蛋白質。淀粉酶和GRP78免疫組化驗證結果與電泳結果一致。 結論：應用相差凝膠電泳和二級質譜的蛋白質組學手段篩選到內質網應激、細胞凋亡等相關蛋白質在高脂血癥性急性胰腺炎中的差異表達。高脂血癥對急性胰腺炎的損傷加重通過多種途徑，且高脂血癥對急性壞死性胰腺炎與急