高脂血癥相關(guān)性急性胰腺炎的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、本研究分為以下二部分： 一、高脂血癥對(duì)胰腺組織損傷機(jī)制的蛋白質(zhì)組學(xué)分析 目的：隨著生活水平的提高，臨床上，高脂血癥的發(fā)病率日趨增多。甘油三酯在脂蛋白脂酶的作用下水解成游離脂肪酸(FFA)，后者進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行氧化代謝供應(yīng)能量或儲(chǔ)存在脂肪內(nèi)。當(dāng)體內(nèi)游離脂肪酸水平增高，超過脂肪組織的儲(chǔ)存能力和各組織對(duì)游離脂肪酸的氧化能力，在器官組織產(chǎn)生脂毒性。長(zhǎng)期暴露于游離脂肪酸中易損害胰島β細(xì)胞釋放胰島素的功能，并誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡，與急性胰腺

2、炎、慢性胰腺炎、非胰島素依賴性糖尿病等疾病關(guān)系密切。本研究以大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，誘導(dǎo)大鼠高甘油三酯血癥模型，從高脂血癥胰腺組織的蛋白質(zhì)組著手，利用相差凝膠電泳質(zhì)譜技術(shù)，尋找高脂血癥狀態(tài)下胰腺組織的差異表達(dá)蛋白，并對(duì)這些差異表達(dá)蛋白分子進(jìn)一步深入研究，以期豐富和完善高脂血癥狀態(tài)下胰腺組織損傷的病理生理變化的分子機(jī)制。 方法：采用斷乳一周雄性SD大鼠，隨機(jī)分成二組，每組5只。其中一組為高脂血癥組，飼以高脂飲食，對(duì)照組飼以普通飼料。試驗(yàn)6

3、周后處死動(dòng)物，取胰腺組織，裂解提取蛋白質(zhì)。對(duì)胰腺組織進(jìn)行相差凝膠電泳(DIGE)，應(yīng)用DeCyder6.5圖像分析軟件將高脂血癥組和正常組胰腺組織膠圖進(jìn)行匹配，不同膠匹配點(diǎn)相對(duì)含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的點(diǎn)為差異蛋白質(zhì)點(diǎn)。對(duì)差異蛋白質(zhì)進(jìn)行膠內(nèi)消化、MALDI-TOF-TOF二級(jí)質(zhì)譜鑒定和數(shù)據(jù)庫搜索確定差異蛋白質(zhì)。采用Western印跡法驗(yàn)證部分差異明顯蛋白質(zhì)表達(dá)情況。 結(jié)果：高脂血癥大鼠胰腺組織病理學(xué)可見腺泡內(nèi)散在的脂肪空泡沉積。胰腺

4、組織相差凝膠電泳重復(fù)性滿意，顯示的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)在分布、背景等方面基本一致。通過DeCyder6.5圖像分析軟件將高脂血癥組和正常組胰腺組織膠圖進(jìn)行匹配，高脂血癥組胰腺組織與正常胰腺組織相比，上調(diào)蛋白質(zhì)3種，下調(diào)蛋白質(zhì)11種。其中上調(diào)蛋白質(zhì)為：精氨酸酶Ⅱ、甘氨酸脒基轉(zhuǎn)移酶和核糖核酸酶抑制劑，高脂血癥組上述蛋白質(zhì)的含量較正常組分別上調(diào)2.19倍、1.82倍和1.12倍；下調(diào)蛋白質(zhì)包括酪氨酰tRNA合成酶、α-淀粉酶、脂肪酶、DJ-1蛋白和Cu

5、、Zn超氧化物歧化酶等，高脂血癥組較正常組分別下調(diào)2.48倍、2.37倍、1.85倍、1.73倍和1.65倍。采用方差分析，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些蛋白質(zhì)在胰腺組織中主要與脂肪消化、細(xì)胞能量代謝、氧化應(yīng)激、膠原合成、細(xì)胞增殖與分化等相關(guān)。Western印跡法證實(shí)高脂血癥組大鼠胰腺組織精氨酸酶Ⅱ表達(dá)較正常胰腺組織明顯增強(qiáng)，α-淀粉酶表達(dá)較正常胰腺組織明顯減弱。 結(jié)論：成功構(gòu)建高脂血癥大鼠模型。利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，從整體

6、角度將蛋白質(zhì)變化綜合在一起，得到高脂血癥大鼠胰腺組織的蛋白質(zhì)組特征性變化。在高脂血癥大鼠的胰腺病理生理改變中，差異表達(dá)的蛋白質(zhì)可能通過脂肪消化、細(xì)胞能量代謝、氧化應(yīng)激、膠原合成、細(xì)胞增殖與分化等途徑對(duì)胰腺組織造成損傷，這些蛋白質(zhì)的改變可能成為高甘油三酯對(duì)胰腺損傷的早期預(yù)警標(biāo)志。 二、高脂血癥合并急性胰腺炎的胰腺組織蛋白質(zhì)組學(xué)分析 目的：急性胰腺炎在臨床發(fā)病率日漸增高，高脂血癥是繼膽源性和酒精源性之后急性胰腺炎的又一重要病

7、因，脂質(zhì)毒性不僅是作為急性胰腺炎的病因，而且能進(jìn)一步加重急性胰腺炎的病情。本實(shí)驗(yàn)通過高脂血癥大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，誘導(dǎo)高脂血癥大鼠合并急性水腫性胰腺炎和高脂血癥合并急性壞死性胰腺炎動(dòng)物模型，利用雙向凝膠電泳質(zhì)譜技術(shù)，尋找高脂血癥合并急性胰腺炎狀態(tài)下胰腺組織的差異表達(dá)蛋白，并對(duì)這些差異表達(dá)蛋白分子進(jìn)一步深入研究，以探討高脂血癥加重急性胰腺炎的胰腺組織病理生理變化的分子機(jī)制。 方法：采用斷乳一周雄性SD大鼠，隨機(jī)分成二組，每組10只。其中

8、一組為高脂血癥組，飼以高脂飲食，對(duì)照組飼以普通飼料。試驗(yàn)6周后高脂組和對(duì)照組均分別予雨蛙肽腹腔內(nèi)注射和牛磺膽酸鈉胰管內(nèi)注射，分別建立急性水腫性胰腺炎和急性壞死性胰腺炎模型，造模后9h處死動(dòng)物，取胰腺組織，裂解提取蛋白質(zhì)。采用相差凝膠電泳(DIGE)，檢測(cè)高脂血癥合并急性胰腺炎組與對(duì)照組的蛋白質(zhì)差異。采用免疫組化驗(yàn)證差異明顯的蛋白質(zhì)表達(dá)情況。 結(jié)果：高脂血癥合并急性水腫性胰腺炎和高脂血癥合并急性壞死性胰腺炎動(dòng)物模型胰腺組織有典型組

9、織病理學(xué)改變。通過DeCyder6.5圖像分析軟件進(jìn)行匹配，高脂血癥急性壞死性胰腺炎組與正常血脂急性壞死性胰腺炎組分析到59個(gè)差異點(diǎn)，39個(gè)差異點(diǎn)經(jīng)質(zhì)譜成功鑒定，23個(gè)點(diǎn)在高脂血癥急性壞死性胰腺炎組上調(diào)，16個(gè)點(diǎn)下調(diào)。高脂血癥急性水腫性胰腺炎組與正常血脂急性水腫性胰腺炎組分析到12個(gè)差異點(diǎn)，7個(gè)差異點(diǎn)經(jīng)質(zhì)譜成功鑒定，2個(gè)點(diǎn)在高脂血癥急性水腫性胰腺炎組上調(diào)，5個(gè)點(diǎn)下調(diào)。差異蛋白質(zhì)主要包括代謝酶類(脂肪酶、淀粉酶、水解碳水化合物的羧基多肽酶

10、、α1抗胰蛋白酶)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和鈣代謝相關(guān)蛋白質(zhì)(GRP78、HSP60、蛋白二硫鍵異構(gòu)酶、鈣網(wǎng)蛋白、膜聯(lián)蛋白)，以及與DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡、循環(huán)障礙、信號(hào)傳導(dǎo)通路等相關(guān)蛋白質(zhì)。淀粉酶和GRP78免疫組化驗(yàn)證結(jié)果與電泳結(jié)果一致。 結(jié)論：應(yīng)用相差凝膠電泳和二級(jí)質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)手段篩選到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等相關(guān)蛋白質(zhì)在高脂血癥性急性胰腺炎中的差異表達(dá)。高脂血癥對(duì)急性胰腺炎的損傷加重通過多種途徑，且高脂血癥對(duì)急性壞死性胰腺炎與急