DBP和DEHP對斑馬魚生長發(fā)育和生殖系統(tǒng)的影響.pdf

1、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)和鄰苯二甲酸(2-乙基己基)酯(DEHP)被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)和塑料制品中，普遍存在于環(huán)境中，對人和動物都有致畸、致癌和致突變的作用，并具有較強的內(nèi)分泌干擾性，已經(jīng)受到了越來越多的關(guān)注。近年來，大量的研究都是使用鼠類模型來研究單一的DBP或DEHP的“三致”效應(yīng)，生殖毒性和發(fā)育毒性等。而很少將兩者聯(lián)合并且使用斑馬魚為實驗?zāi)Ｐ停诎唏R魚中的行為毒性和生殖毒性還未見有報道。
　　 目的：
　　 研究

2、DBP和DEHP對斑馬魚生長發(fā)育和精子活力的影響。
　　 方法：
　　 1．斑馬魚胚胎的收集與挑選
　　 前一天20:00將雌雄魚按6:6進行配對，放入全封閉循環(huán)孵化系統(tǒng)內(nèi)，笠日8:00燈亮后0.5h開始收集。胚胎收集完，經(jīng)清洗、挑選后移入斑馬魚胚胎培養(yǎng)液中，于28℃光照培養(yǎng)箱中以14L:10D光周期培養(yǎng)待用。
　　 2．DBP和DEHP在斑馬魚胚胎中的毒性效應(yīng)
　　 在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上，在0％-1

3、00％的致死劑量范圍內(nèi)設(shè)立6個濃度組(1、5、8、10、15和20μM/L)，吐溫-80和胚胎培養(yǎng)液(EM)為對照組，選用96孔板細胞培養(yǎng)板進行實驗，每孔加一枚胚胎和200μL溶液，每天早上9:00用顯微鏡直接觀察96孔板中的胚胎發(fā)育狀態(tài)，連續(xù)觀察6天。
　　 3．DBP對胚胎不同染毒時間段的窗口效應(yīng)
　　 DBP96hpf-LC50為9.19μM/L的基礎(chǔ)上，設(shè)置4組比它高的濃度(10、12、15和20μM/L)，選用

4、六孔板來進行實驗，每孔10枚胚胎和加5ml溶液，EM為對照，以10h間隔(4-14hpf、14-24hpf、24-34hpf)對胚胎進行窗口染毒，觀察胚胎對DBP的哪個時間段哪個濃度最敏感。
　　 4．細胞凋亡
　　 各濃度組隨機挑選12枚正常的胚胎至6孔板中。染毒18h(6hpf-24hpf)后，將胚胎放在有0.5mg/mL蛋白酶E溶液的培養(yǎng)皿中，在室溫下放置8分鐘。脫膜后的胚胎用5μg/mL吖啶橙溶液在暗室中染色1h

5、，然后用0.04mg/mL的MS222麻醉5min，置載玻片上于熒光顯微鏡下鏡檢拍照。
　　 5．行為學(xué)光刺激的研究
　　 120hpf的幼魚于0、1和5μM/LDBP染毒1h，來檢測DBP對斑馬魚幼魚行為的影響。用24孔板來進行染毒實驗，每孔一條幼魚，2ml溶液，每組60條幼魚。染毒1h后，用斑馬魚行為分析系統(tǒng)檢測。
　　 6．精子活力的測定
　　 DBP96hpf-LC50為9.19μM/L，從而得出

6、安全濃度大約為0.92μM/L，在此基礎(chǔ)上，等對數(shù)濃度差設(shè)置3個質(zhì)量濃度0.41、0.92和2.06μM/LDBP。300μM/LDEHP與以上3個DBP濃度分別聯(lián)合染毒，進行20天慢性毒性實驗。染毒結(jié)束后精子采集激活后，用計算機輔助精子分析儀測定，分析各組活力參數(shù)和運動參數(shù)。
　　 結(jié)果：
　　 通過研究，我們確定了DBP和DEHP對斑馬魚生長發(fā)育和精子活力有影響。毒性效應(yīng)表明，DBP延遲了斑馬魚胚胎孵化的時間，并且隨

7、著濃度和染毒時間的延長，斑馬魚胚胎-幼魚的畸形率和死亡率顯著上升，主要的致畸效應(yīng)是脊柱彎曲和囊腫。窗口實驗證明，20μM/LDBP染毒組在14-24hpf時間段觀察到最高的是卵黃和心包囊腫畸形，并且觀察到各組胚胎在脫毒后，有些非致死性畸形在24小時內(nèi)恢復(fù)正常。在行為學(xué)研究中，發(fā)現(xiàn)DBP對斑馬魚的行為有明顯的抑制作用。細胞凋亡實驗發(fā)現(xiàn)，濃度組中的細胞凋亡數(shù)目明顯多于對照組，且多集中于心包區(qū)、眼部和尾部，與畸形率發(fā)現(xiàn)較高的部位相一致。對成年

8、雄性斑馬魚精子活力的研究中，發(fā)現(xiàn)DBP和DEHP單獨染毒組中，精子總活力(TM)和快速運動精子活力(PM)與對照組和溶劑組比較均有顯著性差異(p＜0.05)。各染毒組中，隨著染毒溶液濃度越大，TM降低越顯著(p＜0.05)，存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。運動速度(VAP、VCL、VSL)、體重、體長和精巢重除復(fù)合染毒組（0.92μM/LDBP和300μM/LDEHP）有顯著降低(p＜0.05)外，其他染毒組組均無明顯差異。此外，我們發(fā)現(xiàn)，高濃度復(fù)

9、合染毒組與其單獨的染毒組比較，DBP和DEHP對精子活力的影響有協(xié)同降低作用。
　　 結(jié)論：
　　 DBP短期染毒對斑馬魚胚胎幼魚的生長發(fā)育有影響，延遲孵化率，使畸形率和死亡率上升。雖然濃度高達300μM/L的DEHP對斑馬魚的生長發(fā)魚沒有顯著的影響，但在細胞凋亡研究中還是觀察到較多的細胞凋亡。DBP和DEHP以及聯(lián)合20天染毒對成年雄性斑馬魚的精子活力有明顯的抑制作用，而且進一步確認TM或PM可以作為生物指標(biāo)來研究成年