黑靈芝多糖的抗腫瘤活性及其分子機制初探.pdf

1、黑靈芝多糖PSG-1是從黑靈芝子實體中提取的多糖組分,主要由木糖、巖藻糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖等組成。大量研究表明,該多糖具有抗氧化、提高免疫力、心肌保護、抗糖尿病、抗腫瘤、抗衰老等作用,但其抗腫瘤作用機制方面的研究甚少,本研究旨在探討PSG-1的抗腫瘤作用及其分子機制,從而為其開發(fā)為一種新型藥品或功能食品提供有價值的理論依據(jù)。
　　本研究分別從體外和體內兩種途徑研究PSG-1的抗腫瘤作用及機制。本課題在現(xiàn)代分子生物學理論及技術

2、的指導下,應用流式細胞術(Flow Cytometry, FCM)、蛋白印跡(Western Blot)、酶聯(lián)免疫(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)及逆轉錄-聚合酶鏈式反應(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)等技術,分別從整體、細胞、分子、基因水平,將PSG-1對荷瘤小鼠的抑制腫瘤生長作用及作用通路進行了深入研究

3、。通過整體和離體兩種途徑進行研究和探討,具體研究如下:
　　在體外研究中,將不同濃度的PSG-1分別直接作用于S180、CT26腫瘤細胞,通過MTT法測定PSG-1對上述兩種腫瘤細胞的增殖抑制作用,結果發(fā)現(xiàn):在體外,各劑量濃度的PSG-1對S180、CT26細胞的增殖抑制率無顯著性差異;這說明PSG-1對S180和CT26腫瘤細胞無直接抑制增殖作用,同時也無細胞毒性。另外,用PSG-1預處理小鼠腹腔巨噬細胞,實驗結果證明:腹腔巨噬

4、細胞吞噬殺傷S180和CT26腫瘤細胞的能力與PSG-1濃度呈劑量依賴性增強。說明PSG-1能有效地活化腹腔巨噬細胞,提高其吞噬殺傷能力。
　　在體內實驗中,首先分別采用S180、CT26腫瘤細胞株建立荷瘤小鼠模型,一周左右后,接種處長出80~90mm3大小的腫瘤說明造模成功。然后將小鼠進行隨機分組,每天灌胃或注射給藥一次。2周后,將部分小鼠首先進行眼眶取血,然后處死,分離出腫瘤和各組織器官;其余部分小鼠用于提取腹腔巨噬細胞和脾細

5、胞實驗,測定細胞相應的功能活性。結果顯示:與對照組相比,PSG-1組小鼠腫瘤抑制率隨劑量升高逐漸增加,脾指數(shù)、胸腺指數(shù)也顯著增加,差異性顯著(P<0.05)。此外,PSG-1組小鼠血清中和腹腔巨噬細胞分泌的細胞因子和一氧化氮(NO)均呈劑量依賴性增加;巨噬細胞的吞噬能力也有效增強,此外PSG-1還顯著提高了T、B淋巴細胞的增殖能力。說明PSG-1在體內具有很強的抑制腫瘤生長的效果,并且能通過改善荷瘤小鼠的免疫功能,間接地起到抗腫瘤作用。

6、
　　為了明確PSG-1抗腫瘤活性的分子機制和作用途徑,本實驗分別從不同的角度做了深入的研究和探討。通過分離純化得到荷瘤小鼠的腹腔巨噬細胞,然后分別加入anti-TLR4抗體、p38 MAPK阻斷劑SB203580和NF-κB特異阻斷劑pyrrolidine dithiocarbamate(PDTC),來探討PSG-1抗腫瘤作用的信號路徑。結果顯示:anti-TLR4抗體能部分阻斷PSG-1誘導的促腹腔巨噬細胞分泌TNF-α的作用

7、,說明TLR4可能是PSG-1在細胞膜上的作用受體之一。特異性阻斷劑SB203580能完全阻滯PSG-1誘導的提高腹腔巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α的作用;此外,PDTC也能夠顯著地抑制PSG-1誘導的TNF-α的分泌。為進一步驗證,本研究運用Western-blotting法測定了TLR4、NF-κB、IκBα以及pp38等蛋白的表達情況。結果顯示,各組荷瘤小鼠中,PSG-1組腹腔巨噬細胞的膜蛋白TLR4表達顯著增加,核蛋白NF-κB表達水平

8、也呈劑量依賴性升高;而細胞質中IκBα的蛋白表達量逐漸降低,并且磷酸化蛋白pp38表達也顯著增強,與對照組相比,具有顯著性差異。實驗結果提示PSG-1通過作用于腹腔巨噬細胞膜上的TLR4受體,將信號傳遞進入細胞,然后激活NF-κB和p38 MAPK信號通路,促進TNF-α的分泌,強化機體免疫力,間接地發(fā)揮抗腫瘤的作用。
　　另外,本研究通過流式細胞術檢測了各組荷瘤模型小鼠的腫瘤細胞的凋亡程度。測定結果顯示PSG-1能顯著地誘導荷瘤

9、小鼠腫瘤細胞的凋亡。通過ELISA活性試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)PSG-1能顯著提高荷瘤小鼠腫瘤細胞中的cAMP、PKA、AC活性,下調DG、cGMP、PKC的活性;Western Blotting法檢測PKA和PKC蛋白的表達,結果顯示PSG-1顯著地促進了PKA蛋白的表達,下調了PKC的蛋白表達量。我們推測, PSG-1可以通過激活cAMP/PKA信號途徑,下調DG-PKC信號通路來誘導并促進腫瘤細胞凋亡,從而抑制抗腫瘤的生長。
　　采用

10、流式細胞術觀察各組荷瘤小鼠腫瘤細胞的線粒體膜電位變化和ROS的產(chǎn)生,發(fā)現(xiàn)PSG-1能有效地促進線粒體膜電位的降低和ROS的產(chǎn)生, Western Blotting檢測細胞色素C、凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2和p53的表達,結果顯示:PSG-1顯著地提高了促凋亡蛋白Bax和p53的表達水平,減少了了抑制凋亡蛋白Bcl-2表達量,同時還促進了線粒體中細胞色素C釋放到細胞質中。此外,通過檢測Caspase-9,-3的活性發(fā)現(xiàn),PSG-1有效