黑靈芝多糖的抗腫瘤活性及其分子機(jī)制初探.pdf

1、黑靈芝多糖PSG-1是從黑靈芝子實(shí)體中提取的多糖組分,主要由木糖、巖藻糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖等組成。大量研究表明,該多糖具有抗氧化、提高免疫力、心肌保護(hù)、抗糖尿病、抗腫瘤、抗衰老等作用,但其抗腫瘤作用機(jī)制方面的研究甚少,本研究旨在探討PSG-1的抗腫瘤作用及其分子機(jī)制,從而為其開(kāi)發(fā)為一種新型藥品或功能食品提供有價(jià)值的理論依據(jù)。
　　本研究分別從體外和體內(nèi)兩種途徑研究PSG-1的抗腫瘤作用及機(jī)制。本課題在現(xiàn)代分子生物學(xué)理論及技術(shù)

2、的指導(dǎo)下,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry, FCM)、蛋白印跡(Western Blot)、酶聯(lián)免疫(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)及逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)等技術(shù),分別從整體、細(xì)胞、分子、基因水平,將PSG-1對(duì)荷瘤小鼠的抑制腫瘤生長(zhǎng)作用及作用通路進(jìn)行了深入研究

3、。通過(guò)整體和離體兩種途徑進(jìn)行研究和探討,具體研究如下:
　　在體外研究中,將不同濃度的PSG-1分別直接作用于S180、CT26腫瘤細(xì)胞,通過(guò)MTT法測(cè)定PSG-1對(duì)上述兩種腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn):在體外,各劑量濃度的PSG-1對(duì)S180、CT26細(xì)胞的增殖抑制率無(wú)顯著性差異;這說(shuō)明PSG-1對(duì)S180和CT26腫瘤細(xì)胞無(wú)直接抑制增殖作用,同時(shí)也無(wú)細(xì)胞毒性。另外,用PSG-1預(yù)處理小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明:腹腔巨噬

4、細(xì)胞吞噬殺傷S180和CT26腫瘤細(xì)胞的能力與PSG-1濃度呈劑量依賴性增強(qiáng)。說(shuō)明PSG-1能有效地活化腹腔巨噬細(xì)胞,提高其吞噬殺傷能力。
　　在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,首先分別采用S180、CT26腫瘤細(xì)胞株建立荷瘤小鼠模型,一周左右后,接種處長(zhǎng)出80~90mm3大小的腫瘤說(shuō)明造模成功。然后將小鼠進(jìn)行隨機(jī)分組,每天灌胃或注射給藥一次。2周后,將部分小鼠首先進(jìn)行眼眶取血,然后處死,分離出腫瘤和各組織器官;其余部分小鼠用于提取腹腔巨噬細(xì)胞和脾細(xì)

5、胞實(shí)驗(yàn),測(cè)定細(xì)胞相應(yīng)的功能活性。結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,PSG-1組小鼠腫瘤抑制率隨劑量升高逐漸增加,脾指數(shù)、胸腺指數(shù)也顯著增加,差異性顯著(P<0.05)。此外,PSG-1組小鼠血清中和腹腔巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和一氧化氮(NO)均呈劑量依賴性增加;巨噬細(xì)胞的吞噬能力也有效增強(qiáng),此外PSG-1還顯著提高了T、B淋巴細(xì)胞的增殖能力。說(shuō)明PSG-1在體內(nèi)具有很強(qiáng)的抑制腫瘤生長(zhǎng)的效果,并且能通過(guò)改善荷瘤小鼠的免疫功能,間接地起到抗腫瘤作用。

6、
　　為了明確PSG-1抗腫瘤活性的分子機(jī)制和作用途徑,本實(shí)驗(yàn)分別從不同的角度做了深入的研究和探討。通過(guò)分離純化得到荷瘤小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞,然后分別加入anti-TLR4抗體、p38 MAPK阻斷劑SB203580和NF-κB特異阻斷劑pyrrolidine dithiocarbamate(PDTC),來(lái)探討PSG-1抗腫瘤作用的信號(hào)路徑。結(jié)果顯示:anti-TLR4抗體能部分阻斷PSG-1誘導(dǎo)的促腹腔巨噬細(xì)胞分泌TNF-α的作用

7、,說(shuō)明TLR4可能是PSG-1在細(xì)胞膜上的作用受體之一。特異性阻斷劑SB203580能完全阻滯PSG-1誘導(dǎo)的提高腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的作用;此外,PDTC也能夠顯著地抑制PSG-1誘導(dǎo)的TNF-α的分泌。為進(jìn)一步驗(yàn)證,本研究運(yùn)用Western-blotting法測(cè)定了TLR4、NF-κB、IκBα以及pp38等蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,各組荷瘤小鼠中,PSG-1組腹腔巨噬細(xì)胞的膜蛋白TLR4表達(dá)顯著增加,核蛋白NF-κB表達(dá)水平

8、也呈劑量依賴性升高;而細(xì)胞質(zhì)中IκBα的蛋白表達(dá)量逐漸降低,并且磷酸化蛋白pp38表達(dá)也顯著增強(qiáng),與對(duì)照組相比,具有顯著性差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示PSG-1通過(guò)作用于腹腔巨噬細(xì)胞膜上的TLR4受體,將信號(hào)傳遞進(jìn)入細(xì)胞,然后激活NF-κB和p38 MAPK信號(hào)通路,促進(jìn)TNF-α的分泌,強(qiáng)化機(jī)體免疫力,間接地發(fā)揮抗腫瘤的作用。
　　另外,本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了各組荷瘤模型小鼠的腫瘤細(xì)胞的凋亡程度。測(cè)定結(jié)果顯示PSG-1能顯著地誘導(dǎo)荷瘤

9、小鼠腫瘤細(xì)胞的凋亡。通過(guò)ELISA活性試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PSG-1能顯著提高荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞中的cAMP、PKA、AC活性,下調(diào)DG、cGMP、PKC的活性;Western Blotting法檢測(cè)PKA和PKC蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示PSG-1顯著地促進(jìn)了PKA蛋白的表達(dá),下調(diào)了PKC的蛋白表達(dá)量。我們推測(cè), PSG-1可以通過(guò)激活cAMP/PKA信號(hào)途徑,下調(diào)DG-PKC信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,從而抑制抗腫瘤的生長(zhǎng)。
　　采用

10、流式細(xì)胞術(shù)觀察各組荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞的線粒體膜電位變化和ROS的產(chǎn)生,發(fā)現(xiàn)PSG-1能有效地促進(jìn)線粒體膜電位的降低和ROS的產(chǎn)生, Western Blotting檢測(cè)細(xì)胞色素C、凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2和p53的表達(dá),結(jié)果顯示:PSG-1顯著地提高了促凋亡蛋白Bax和p53的表達(dá)水平,減少了了抑制凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量,同時(shí)還促進(jìn)了線粒體中細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中。此外,通過(guò)檢測(cè)Caspase-9,-3的活性發(fā)現(xiàn),PSG-1有效