黑靈芝多糖的抗腫瘤活性及其分子機制初探.pdf

1、黑靈芝多糖PSG-1是從黑靈芝子實體中提取的多糖組分,主要由木糖、巖藻糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖等組成。大量研究表明,該多糖具有抗氧化、提高免疫力、心肌保護、抗糖尿病、抗腫瘤、抗衰老等作用,但其抗腫瘤作用機制方面的研究甚少,本研究旨在探討PSG-1的抗腫瘤作用及其分子機制,從而為其開發(fā)為一種新型藥品或功能食品提供有價值的理論依據(jù)。
　　本研究分別從體外和體內(nèi)兩種途徑研究PSG-1的抗腫瘤作用及機制。本課題在現(xiàn)代分子生物學理論及技術(shù)

2、的指導(dǎo)下,應(yīng)用流式細胞術(shù)(Flow Cytometry, FCM)、蛋白印跡(Western Blot)、酶聯(lián)免疫(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)及逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)等技術(shù),分別從整體、細胞、分子、基因水平,將PSG-1對荷瘤小鼠的抑制腫瘤生長作用及作用通路進行了深入研究

3、。通過整體和離體兩種途徑進行研究和探討,具體研究如下:
　　在體外研究中,將不同濃度的PSG-1分別直接作用于S180、CT26腫瘤細胞,通過MTT法測定PSG-1對上述兩種腫瘤細胞的增殖抑制作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn):在體外,各劑量濃度的PSG-1對S180、CT26細胞的增殖抑制率無顯著性差異;這說明PSG-1對S180和CT26腫瘤細胞無直接抑制增殖作用,同時也無細胞毒性。另外,用PSG-1預(yù)處理小鼠腹腔巨噬細胞,實驗結(jié)果證明:腹腔巨噬

4、細胞吞噬殺傷S180和CT26腫瘤細胞的能力與PSG-1濃度呈劑量依賴性增強。說明PSG-1能有效地活化腹腔巨噬細胞,提高其吞噬殺傷能力。
　　在體內(nèi)實驗中,首先分別采用S180、CT26腫瘤細胞株建立荷瘤小鼠模型,一周左右后,接種處長出80~90mm3大小的腫瘤說明造模成功。然后將小鼠進行隨機分組,每天灌胃或注射給藥一次。2周后,將部分小鼠首先進行眼眶取血,然后處死,分離出腫瘤和各組織器官;其余部分小鼠用于提取腹腔巨噬細胞和脾細

5、胞實驗,測定細胞相應(yīng)的功能活性。結(jié)果顯示:與對照組相比,PSG-1組小鼠腫瘤抑制率隨劑量升高逐漸增加,脾指數(shù)、胸腺指數(shù)也顯著增加,差異性顯著(P<0.05)。此外,PSG-1組小鼠血清中和腹腔巨噬細胞分泌的細胞因子和一氧化氮(NO)均呈劑量依賴性增加;巨噬細胞的吞噬能力也有效增強,此外PSG-1還顯著提高了T、B淋巴細胞的增殖能力。說明PSG-1在體內(nèi)具有很強的抑制腫瘤生長的效果,并且能通過改善荷瘤小鼠的免疫功能,間接地起到抗腫瘤作用。

6、
　　為了明確PSG-1抗腫瘤活性的分子機制和作用途徑,本實驗分別從不同的角度做了深入的研究和探討。通過分離純化得到荷瘤小鼠的腹腔巨噬細胞,然后分別加入anti-TLR4抗體、p38 MAPK阻斷劑SB203580和NF-κB特異阻斷劑pyrrolidine dithiocarbamate(PDTC),來探討PSG-1抗腫瘤作用的信號路徑。結(jié)果顯示:anti-TLR4抗體能部分阻斷PSG-1誘導(dǎo)的促腹腔巨噬細胞分泌TNF-α的作用

7、,說明TLR4可能是PSG-1在細胞膜上的作用受體之一。特異性阻斷劑SB203580能完全阻滯PSG-1誘導(dǎo)的提高腹腔巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α的作用;此外,PDTC也能夠顯著地抑制PSG-1誘導(dǎo)的TNF-α的分泌。為進一步驗證,本研究運用Western-blotting法測定了TLR4、NF-κB、IκBα以及pp38等蛋白的表達情況。結(jié)果顯示,各組荷瘤小鼠中,PSG-1組腹腔巨噬細胞的膜蛋白TLR4表達顯著增加,核蛋白NF-κB表達水平

8、也呈劑量依賴性升高;而細胞質(zhì)中IκBα的蛋白表達量逐漸降低,并且磷酸化蛋白pp38表達也顯著增強,與對照組相比,具有顯著性差異。實驗結(jié)果提示PSG-1通過作用于腹腔巨噬細胞膜上的TLR4受體,將信號傳遞進入細胞,然后激活NF-κB和p38 MAPK信號通路,促進TNF-α的分泌,強化機體免疫力,間接地發(fā)揮抗腫瘤的作用。
　　另外,本研究通過流式細胞術(shù)檢測了各組荷瘤模型小鼠的腫瘤細胞的凋亡程度。測定結(jié)果顯示PSG-1能顯著地誘導(dǎo)荷瘤

9、小鼠腫瘤細胞的凋亡。通過ELISA活性試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)PSG-1能顯著提高荷瘤小鼠腫瘤細胞中的cAMP、PKA、AC活性,下調(diào)DG、cGMP、PKC的活性;Western Blotting法檢測PKA和PKC蛋白的表達,結(jié)果顯示PSG-1顯著地促進了PKA蛋白的表達,下調(diào)了PKC的蛋白表達量。我們推測, PSG-1可以通過激活cAMP/PKA信號途徑,下調(diào)DG-PKC信號通路來誘導(dǎo)并促進腫瘤細胞凋亡,從而抑制抗腫瘤的生長。
　　采用

10、流式細胞術(shù)觀察各組荷瘤小鼠腫瘤細胞的線粒體膜電位變化和ROS的產(chǎn)生,發(fā)現(xiàn)PSG-1能有效地促進線粒體膜電位的降低和ROS的產(chǎn)生, Western Blotting檢測細胞色素C、凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2和p53的表達,結(jié)果顯示:PSG-1顯著地提高了促凋亡蛋白Bax和p53的表達水平,減少了了抑制凋亡蛋白Bcl-2表達量,同時還促進了線粒體中細胞色素C釋放到細胞質(zhì)中。此外,通過檢測Caspase-9,-3的活性發(fā)現(xiàn),PSG-1有效