家蠶黑化免疫初探.pdf

1、節(jié)肢動物的免疫防御完全依賴于先天性免疫，當病原物入侵時，它們只能依靠先天性免疫進行廣譜性應答。先天性免疫是否發(fā)達是衡量節(jié)肢動物抗病能力強弱的決定性因素。黑色素形成沉積于入侵病原物表面是節(jié)肢動物進行免疫應答的重要表現(xiàn)，在免疫中發(fā)生黑化是節(jié)肢動物免疫應答唯一可以直接觀察的標志。因此，從黑化免疫入手研究昆蟲先天性免疫機制很早就受到人們的關注，尤其是在果蠅和蚊子等昆蟲。
　　 家蠶是有重要經(jīng)濟價值的益蟲，但易遭受多種病原體的侵襲，往往造

2、成生產(chǎn)上的巨大損失。因此，研究揭示家蠶先天免疫機制對提高家蠶抗病能力和預防蠶病的發(fā)生具有重要的理論價值。同時，家蠶也是鱗翅目昆蟲重要的分子模型，研究揭示家蠶先天免疫機制有利于推動鱗翅目其它昆蟲的相關研究，為鱗翅目害蟲的防治提供新的途徑。
　　 目前，關于家蠶先天性免疫的研究報道主要集中在抗菌肽、模式識別蛋白以及信號通路等方面，而對于家蠶黑化免疫的報道卻很少。本文從比較病黑蠶與正常蠶之間基因表達差異、體外黑化誘導、活體免疫誘導以及

3、相關物質對細菌生長的影響等四個方面來探尋參與家蠶免疫黑化的基因等。主要研究結果如下:
　　 1.參與家蠶黑化免疫候選基因的篩選
　　 用熒光定量PCR(qPCR)分析正常熟蠶和同期病黑蠶之間黑色素代謝途徑上基因的表達量差異，結果顯示:BmYellow-f、BmTan、BmDat等3個基因的表達量在兩種蠶體之間無顯著性差異，BmPAH在病黑蠶中的表達量下調了8倍左右，BmTH、BmBlack、BmDDC、BmYellow、

4、BmEbony等基因在病黑蠶中的表達量與正常熟蠶相比顯著增加(P＜0.001)。
　　 2.體液黑化免疫的體外實驗
　　 用來自真菌（酵母菌）的甘露聚糖，來自革蘭氏陽性菌的肽聚糖(PGN)和來自革蘭氏陰性菌的脂多糖(LPS)等3種微生物細胞壁重要物質分子，在體外進行誘導家蠶體液的黑化免疫實驗，結果顯示:3種物質均能誘導家蠶體液發(fā)生黑化，其中脂多糖(LPS)比甘露聚糖和肽聚糖(PGN)誘導家蠶體液發(fā)生黑化的速度更快、程度更

5、強。
　　 用在病黑蠶中明顯上調表達的BmDDC基因對應的DDC蛋白酶的活性抑制劑（卡比多巴），對能強烈快速誘導家蠶體液發(fā)生黑化的脂多糖(LPS)進行黑化抑制實驗，結果顯示:卡比多巴能抑制脂多糖(LPS)誘導的家蠶體液黑化。這表明家蠶體液黑化免疫確實需要DDC活性。
　　 3.免疫誘導分析
　　 用大腸桿菌（革蘭氏陰性菌）和枯草桿菌（革蘭氏陽性菌）注射攻擊家蠶，誘導家蠶免疫應答，用半定量RT-PCR分析攻擊后家蠶

6、血細胞中黑色素代謝相關基因BmPAH、BmTH、BmDDC、BmYellow、BmEbony、BmTan、BmDat和酚氧化酶基因BmPO1、BmPO-1S、BmPO-2S的表達變化，結果顯示:酚氧化酶基因BmPO1表達有下調趨勢，BmPO-1S、BmPO-2S表達與入侵關系不明顯;黑色素代謝相關基因BmTH、BmDDC、BmTan表達量有上調趨勢，BmPAH、BmDat表達量有下調趨勢，這與病黑蠶中表達情況大體一致;只有在革蘭氏陰性菌

7、入侵時能檢測到BmYellow短暫的微量表達，所有樣品中未能檢測到BmEbony表達。
　　 4.抑菌分析
　　 在培養(yǎng)基中加入phe或tyr，大腸桿菌的生長與對照組無明顯差異，培養(yǎng)基也沒有明顯變黑表現(xiàn);在培養(yǎng)基中加入dopa或DA，大腸桿菌的菌落形成數(shù)明顯比對照少，生長明顯受到抑制，培養(yǎng)基也有明顯變黑表現(xiàn)。這說明phe和tyr在空氣中不能衍生成黑色素，沒有或很少對大腸桿菌有殺滅作用，而dopa和DA在空氣中能衍生成黑色