細(xì)枝木麻黃再生體系及農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、細(xì)枝木麻黃（Casuarina cunninghamiana Miq.）是我國(guó)木麻黃沿海防護(hù)林重要的三大樹種之一，能夠抗干旱、耐瘠薄、耐鹽堿，具有速生、抗風(fēng)、生物固氮等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于沿海沙地和造林困難立地的固氮改土、防風(fēng)固沙、鹽堿地改良和建立農(nóng)林復(fù)合系統(tǒng)，是熱帶、亞熱帶地區(qū)具有多用途的造林先鋒樹種，也是薪炭和造紙等多用途樹種。近些年來(lái)，由于為獲得經(jīng)濟(jì)價(jià)值而追求木材產(chǎn)出，長(zhǎng)期使用少數(shù)幾個(gè)木麻黃無(wú)性系造成木麻黃防護(hù)林遺傳多樣性狹窄且防護(hù)能

2、力降低。同時(shí)，開采濱海鋯鈦礦、圍堤養(yǎng)殖等因素加劇了沿海土地沙化和鹽堿化，使木麻黃人工林出現(xiàn)明顯衰退現(xiàn)象，影響當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展和危及生態(tài)安全。因此，選育和創(chuàng)制適合新環(huán)境下的木麻黃抗逆新材料或新品種，對(duì)現(xiàn)有木麻黃材料進(jìn)行更新和替換，成為當(dāng)前木麻黃研究的重點(diǎn)任務(wù)。
　　本文以細(xì)枝木麻黃為材料，建立細(xì)枝木麻黃愈傷組織再生體系和根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系，篩選了3個(gè)細(xì)枝木麻黃無(wú)性系材料，并進(jìn)行外源基因轉(zhuǎn)化研究，研究旨在構(gòu)建細(xì)枝木麻黃轉(zhuǎn)基因研究

3、體系，為木麻黃基因工程育種提供技術(shù)平臺(tái)。同時(shí)，為今后細(xì)枝木麻黃基因功能研究和表達(dá)分析奠定基礎(chǔ)。本研究主要結(jié)論如下：
　　1）以細(xì)枝木麻黃平潭3號(hào)無(wú)菌實(shí)生苗上胚軸為起始外植體，研究了植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、蔗糖、pH值、AgNO3等因素對(duì)細(xì)枝木麻黃愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)及愈傷組織芽分化和芽伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明：MSC+0.54μmol/L NAA+3.30μmol/L BAP+30 g/L蔗糖及pH值為5.9是細(xì)枝木麻黃愈傷組織誘導(dǎo)培

4、養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基配方，培養(yǎng)1 mon能夠獲得94％以上的愈傷組織誘導(dǎo)率和愈傷組織大小直徑均值達(dá)到4.42 mm。在此培養(yǎng)基上愈傷組織增殖培養(yǎng)2 mon，通過(guò)進(jìn)一步改良培養(yǎng)基（添加1 mg/L AgNO3和降低NAA濃度至0.27μmol/L）后繼續(xù)培養(yǎng)2 mon，能夠獲得愈傷組織芽分化率47.5%、平均愈傷組織再生芽數(shù)27.38個(gè)和平均愈傷組織芽（芽長(zhǎng)≥2 cm）數(shù)4.75個(gè)。獲得的再生芽經(jīng)過(guò)含25μmol/L NAA的MSC液體培養(yǎng)基處

5、理3 d，生根培養(yǎng)1 mon后能夠獲得92%的出根率，通過(guò)溫室煉苗并移栽4周后，再生植株成活率達(dá)到80%以上。愈傷組織芽分化過(guò)程的掃描電鏡和石蠟切片觀察分析結(jié)果表明：芽分化是由胚性細(xì)胞形成的胚性愈傷組織分化而來(lái)，形成的胚狀體數(shù)量多，繁殖系數(shù)大。
　　2）以細(xì)枝木麻黃平潭3號(hào)無(wú)菌實(shí)生苗上胚軸為受體材料，通過(guò)卡那霉素濃度、頭孢霉素濃度、共培養(yǎng)時(shí)間、侵染菌液濃度、以及添加乙酰丁香酮等因素試驗(yàn)，探討其對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響，建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的

6、細(xì)枝木麻黃遺傳轉(zhuǎn)化體系。研究發(fā)現(xiàn)：愈傷組織誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)時(shí)卡那霉素工作濃度為20 mg/L和愈傷組織增殖和芽分化篩選培養(yǎng)工作濃度為50 mg/L，能夠有效抑制非轉(zhuǎn)化材料的生長(zhǎng)；頭孢霉素工作濃度為200 mg/L是細(xì)枝木麻黃遺傳轉(zhuǎn)化研究作為脫菌劑使用的最佳濃度；共培養(yǎng)時(shí)間5 d、侵染液濃度OD600nm為0.2和添加乙酰丁香酮50μmol/L時(shí)，能夠獲得88.89%的瞬時(shí)遺傳轉(zhuǎn)化率和40.66%的gus基因瞬時(shí)表達(dá)率。
　　3）以根癌

7、農(nóng)桿菌菌株 C58C1（載體質(zhì)粒 pBIN35GUSINT）介導(dǎo)細(xì)枝木麻黃平潭3號(hào)無(wú)菌實(shí)生苗上胚軸進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，通過(guò)各階段的抗生素篩選培養(yǎng)，成功獲得一些轉(zhuǎn)gus基因植株，對(duì)5個(gè)轉(zhuǎn)基因植株樣品進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定結(jié)果表明：PCR檢測(cè) T-DNA區(qū)gus（uidA）、nptⅡ基因、以及Vir區(qū)virD1基因顯示gus基因已成功轉(zhuǎn)入到這5株植株當(dāng)中，PCR產(chǎn)物測(cè)序驗(yàn)證轉(zhuǎn)入的基因序列是目的基因序列，進(jìn)一步通過(guò)Southern blot雜交分析，均

8、能雜交出條帶，表明目的基因成功整合到細(xì)枝木麻黃植物基因組DNA中。對(duì)細(xì)枝木麻黃轉(zhuǎn)基因植株及對(duì)照植株進(jìn)行接種Frankia試驗(yàn)均能正常結(jié)瘤，結(jié)果表明細(xì)枝木麻黃基因遺傳轉(zhuǎn)化后沒(méi)有改變植株與Frankia共生特性，轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)生的根瘤經(jīng)gus組織化學(xué)染色結(jié)果表明基因成功在根瘤組織中表達(dá)。
　　4）以細(xì)枝木麻黃平潭3號(hào)實(shí)生苗為材料，通過(guò)苗期選擇獲得3個(gè)具有高生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的無(wú)性系PT3-1、PT3-2和PT3-3，愈傷組織芽分化頻率分別為48.