小反芻獸疫血清抗體免疫過氧化物酶單層試驗檢測方法的建立.pdf

1、小反芻獸疫(Peste des petits ruminants，PPR)是由副粘病毒科麻疹病毒屬的小反芻獸疫病毒(Pest des petits ruminants virus，PPRV)引起的一種急性、高度接觸性烈性傳染病，主要感染山羊和綿羊等小反芻動物。PPR自1942年在非洲被發(fā)現(xiàn)以來，不斷向全球蔓延。2007年7月，我國首次在西藏爆發(fā)PPR疫情，2013年至2014年全國19個省區(qū)再次爆發(fā)PPR疫情，對我國養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損

2、失。2015年4月，在科特迪瓦首都阿比讓舉行的動物衛(wèi)生專家會議一致同意，嘗試在全球消除小反芻獸疫病毒。因此，盡快開展小反芻獸疫的病原學、流行病學、診斷與預防控制技術的綜合性研究，建立快速敏感的診斷方法對PPR的防控具有深遠的社會和經(jīng)濟意義。
　　目前針對PPRV的診斷方法較多，其中血清學檢測方法主要是病毒中和試驗(virusneutralization test，VNT)和競爭ELISA方法，但前者存在操作周期長，因操作活病毒而設

3、施要求高等缺點;后者存在價格較貴、制備復雜等缺點。免疫過氧化酶單層試驗(immunoperoxidasemonolayer assay，IPMA)具有快速、敏感、特異、操作簡單的特點，已應用于多種病原的血清臨床樣本檢測。但國內外還沒有建立針對PPRV的IPMA檢測方法，因此建立PPRV-IPMA檢測方法對于PPR疫情的監(jiān)測和防控具有一定的重要意義。
　　為建立針對PPR的IPMA檢測方法，本研究首先建立了穩(wěn)定表達山羊SLAM的BH

4、K-21細胞系(BHK-gSLAM)。rPPRV/GFP感染該細胞系后，能復制增殖且形成明顯的合胞體，而在親本細胞上無該現(xiàn)象。Westem blot試驗表明該細胞系能穩(wěn)定表達SLAM蛋白至少20代。在細胞系建立的基礎上，通過感染rPPRV/GFP制備抗原檢測板，建立了IPMA檢測方法，具體步驟如下:首先比較了Vero細胞和BHK-gSLAM兩者在IPMA試驗中的差別，結果表明，在IPMA反應板制備過程中，同等劑量的rPPRV/GFP感染

5、Vero和BHK-gSLAM細胞，后者病變形成時間更早，并形成易于觀察的合胞體;BHK-gSLAM細胞生長更緊密，形成的CPE更明顯，其在AEC染色后更易于觀察，因此最終選擇該細胞系用于IPMA抗原檢測板的制備。其次，本研究優(yōu)化并確定了IPMA的最佳接毒劑量為104 TCID50/mL，病毒感染72 h后固定制備IPMA反應板，血清最佳起始稀釋度為1∶10，二抗最佳工作濃度為1∶5000。最后，用該IPMA檢測方法對198份羊血清（包括