水稻胚性愈傷組織分化相關(guān)基因的研究.pdf

1、水稻（Oryza sativaL.）是我國(guó)主要的糧食作物之一，也是一種在科學(xué)研究中常用的模式生物。常規(guī)的水稻遺傳育種大大的限制了水稻功能基因組學(xué)的發(fā)展，而轉(zhuǎn)基因技術(shù)的飛速發(fā)展與應(yīng)用則對(duì)水稻的轉(zhuǎn)基因育種產(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響。到目前為止，成熟的水稻轉(zhuǎn)基因技術(shù)僅僅應(yīng)用于少數(shù)幾種粳稻品種，如ZH11，日本晴等。對(duì)于目前一些具有轉(zhuǎn)基因改良價(jià)值的秈稻品種，如93-11，其轉(zhuǎn)基因效率卻是十分低的。因而對(duì)一些重要的水稻品種進(jìn)行組織培養(yǎng)能力和基因轉(zhuǎn)化效率的探索

2、成為目前水稻轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究的一個(gè)重要方向。而新一代的基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9，因其能夠?qū)χ参锘蚪M特定位點(diǎn)進(jìn)行準(zhǔn)確的定點(diǎn)編輯，為探索水稻胚性愈傷分化相關(guān)基因的研究工作提供了有力的工具。
　　本研究主要通過(guò)兩個(gè)方面對(duì)水稻胚性愈傷分化相關(guān)基因的研究工作進(jìn)行了相關(guān)探索。一是通過(guò)對(duì)ZH11分化一段時(shí)間的愈傷進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和i-TRAQ分析，篩選到一些可能和水稻胚性愈傷分化相關(guān)的基因。二是對(duì)一些可能和水稻胚性愈傷分化相關(guān)基因進(jìn)行C

3、RISPR/Cas9基因敲除。
　　1.通過(guò)對(duì)水稻品種ZH11的分化時(shí)期的胚性愈傷提取RNA并做了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和i-TRAQ分析，找到了若干個(gè)和水稻胚性愈傷分化相關(guān)的基因，RicexPro網(wǎng)站上的基因編號(hào)分別為 LOC_Os04g33240（TFT12），LOC_Os05g05930（TFT14），LOC_Os05g28210（EMP）。
　　2.通過(guò)對(duì)TFT12和TFT14這兩個(gè)基因的突變體材料和對(duì)應(yīng)的野生型材料進(jìn)行再生能力

4、差異對(duì)比，發(fā)現(xiàn)在愈傷誘導(dǎo)水平上突變體材料和野生型材料之間并未有明顯差異，但是在突變體材料的再生能力明顯低于野生型材料。
　　3. TFT12基因編碼區(qū)全長(zhǎng)為828bp，實(shí)時(shí)定量PCR分析TFT12主要在生殖生長(zhǎng)的葉、根、內(nèi)稃處高表達(dá)；TFT14基因編碼區(qū)全長(zhǎng)為582bp，實(shí)時(shí)定量PCR分析TFT14主要在胚以及胚乳處高表達(dá)；EMP基因編碼區(qū)全長(zhǎng)為288bp，實(shí)時(shí)定量PCR分析EMP主要在胚及胚乳高表達(dá)。
　　4. EMP基因

5、在野生型材料ZH11的水稻種胚萌發(fā)的48hr過(guò)程中，其表達(dá)量是逐漸上升的，但是在轉(zhuǎn)基因材料EMPi在添加了誘導(dǎo)劑β-雌二醇的情況下萌發(fā)，該基因的表達(dá)量是先升高之后在下降。
　　5.在 EMPi材料種胚萌發(fā)過(guò)程中，轉(zhuǎn)基因材料在添加了誘導(dǎo)劑β-雌二醇的情況下萌發(fā)率相對(duì)于野生型水稻的種胚的萌發(fā)率會(huì)出現(xiàn)一定程度的下降。
　　6. EMP基因表達(dá)的蛋白質(zhì)含95個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子量約為10kDa，我們通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)找到了玉米、小麥

6、、擬南芥等的同源蛋白序列，并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。
　　7.同樣是基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和i-TRAQ分析，找到了另外一些基因的表達(dá)量發(fā)生較為明顯的變化，其中CKO1（LOC_Os01g09260）和Cht2（LOC_Os05g33130)表達(dá)量上調(diào)，而IAA20(LOC_Os06g07040)表達(dá)量下調(diào)。
　　8.利用本實(shí)驗(yàn)室自主創(chuàng)建的簡(jiǎn)便、高效的多靶點(diǎn)編輯 CRISPR/Cas9系統(tǒng)，分別對(duì) Cht2和 IAA20這兩個(gè)基因構(gòu)建了單