龍眼胚性愈傷組織限制生長(zhǎng)保存及其生理與遺傳機(jī)理的研究.pdf

1、龍眼是我們南方重要熱帶亞熱帶特產(chǎn)果樹(shù)。本研究以龍眼胚性培養(yǎng)物為材料，進(jìn)行龍眼種質(zhì)資源離體保存研究。試驗(yàn)進(jìn)行了龍眼胚性愈傷組織(embryogenic callus，EC)限制生長(zhǎng)保存條件優(yōu)化，限制生長(zhǎng)保存后龍眼EC的體胚發(fā)生與植株再生，龍眼EC限制生長(zhǎng)保存過(guò)程中可溶性糖、淀粉以及有機(jī)酸含量的變化，龍眼EC限制生長(zhǎng)保存及體胚發(fā)生過(guò)程中染色體數(shù)目變異以及RAPD分析。主要研究結(jié)果如下： 1.龍眼EC限制生長(zhǎng)保存條件優(yōu)化 試驗(yàn)

2、以紅核子龍眼EC為供試材料，比較了不同濃度甘露醇、不同濃度肌醇、不同接種量、甘露醇和肌醇交互培養(yǎng)、不同濃度蔗糖、不同濃度瓊脂、不同濃度PP333、不同鹽濃度以及光質(zhì)對(duì)龍眼EC生長(zhǎng)的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明：在本試驗(yàn)范圍內(nèi)，瓊脂、PP333、鹽濃度以及光質(zhì)對(duì)龍眼EC限制生長(zhǎng)保存影響效果不顯著，而添加20g/L甘露醇、0.1 g/L的肌醇，并把接種量控制在0.1g/瓶，龍眼EC的繼代周期可延長(zhǎng)到70d左右。 2.限制生長(zhǎng)保存后龍眼EC的體

3、胚發(fā)生與植株再生 試驗(yàn)從保存的52份龍眼EC中，隨機(jī)抽取了15個(gè)(鳳梨穗、松風(fēng)本Ⅱ、雞蛋本、苗翹、云本、油潭本、福眼、青殼蕉、普明庵、血絲、紅核子、公媽本、立冬本、巨龍105、雙孖木)離體保存的龍眼EC，對(duì)其進(jìn)行體胚誘導(dǎo)、成熟、植株再生以及體胚苗移栽的研究，以檢測(cè)離體保存的龍眼EC的體胚發(fā)生能力，同時(shí)為不同龍眼品種體胚發(fā)生提供參考。15個(gè)龍眼品種的體胚誘導(dǎo)研究表明：15個(gè)龍眼品種、不同蔗糖濃度、有機(jī)附加物、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、光質(zhì)對(duì)體胚

4、發(fā)生的時(shí)間、數(shù)量以及質(zhì)量在不同程度上有一定的影響，胚狀體在15-35d皆先后形成，多為白色小子葉胚，分化頻率為100％，形成數(shù)量從2550-13220個(gè)/g不等；體胚成熟研究表明：15個(gè)龍眼品種、不同蔗糖濃度、有機(jī)附加物、光質(zhì)對(duì)胚狀體的大小、形態(tài)都存在一定的影響，胚狀體多白色增大，大小在5-15mm不等；植株再生研究表明：15個(gè)龍眼品種、不同成熟時(shí)間、不同胚狀體、光質(zhì)對(duì)體胚萌發(fā)率以及再生苗長(zhǎng)勢(shì)影響顯著，多數(shù)正常成熟體胚在15d左右就萌發(fā)

5、，萌發(fā)率從50％-93％不等；體胚苗移栽研究表明體胚苗移栽到沙土(泥炭土：沙子=1：2)基質(zhì)上，苗成活率可達(dá)83.33％。因此，限制生長(zhǎng)保存后的15個(gè)龍眼品種EC仍保持強(qiáng)烈的體胚發(fā)生與植株再生能力。 3.龍眼EC限制生長(zhǎng)保存過(guò)程中可溶性糖、淀粉以及有機(jī)酸含量的變化 試驗(yàn)以限制生長(zhǎng)保存的龍眼EC為材料，測(cè)定了紅核子、松風(fēng)本、苗翹在4種不同培養(yǎng)基中限制生長(zhǎng)保存過(guò)程中的可溶性糖、淀粉以及有機(jī)酸含量的變化。對(duì)不同龍眼品種在不同培

6、養(yǎng)基保存過(guò)程中可溶性總糖、淀粉的變化研究表明：龍眼不同基因型以及不同培養(yǎng)基限制生長(zhǎng)保存過(guò)程中總糖含量變化都有所不同。紅核子與苗翹在A、B培養(yǎng)基中，出現(xiàn)積累高峰較C、D培養(yǎng)基早，且紅核子在D培養(yǎng)基中、苗翹在C、D培養(yǎng)基中出現(xiàn)3次積累高峰。松風(fēng)本在A、D培養(yǎng)基中只有1次積累高峰，而在B、C培養(yǎng)基中有兩次積累高峰；龍眼同一基因型在不同培養(yǎng)基限制生長(zhǎng)保存過(guò)程中淀粉含量有所不同，但龍眼EC限制生長(zhǎng)保存過(guò)程中淀粉與總糖含量變化基本一致。 對(duì)

7、不同龍眼品種在不同培養(yǎng)基保存過(guò)程中有機(jī)酸含量的變化研究表明：龍眼EC在不同培養(yǎng)基限制生長(zhǎng)保存過(guò)程中有機(jī)酸含量總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在培養(yǎng)前期出現(xiàn)有機(jī)酸積累高峰有所不同，積累高峰的出現(xiàn)是有機(jī)酸的積累達(dá)到一個(gè)高度，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，EC的逐漸衰老，有機(jī)酸含量整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。 4.龍眼EC限制生長(zhǎng)保存及體胚發(fā)生過(guò)程中染色體數(shù)目變異 試驗(yàn)對(duì)保存的龍眼EC及其體胚發(fā)生過(guò)程中染色體數(shù)目的變異進(jìn)行研究，以尋求降低變異的途徑。試驗(yàn)結(jié)表明

8、：胚性愈傷組織中多倍化細(xì)胞占12.4％，二倍體細(xì)胞比例為85.0％；球形胚中多倍化細(xì)胞占8.4％，二倍體細(xì)胞比例為89.4％；子葉胚中多倍化細(xì)胞占4.8％，二倍體細(xì)胞比例為94.4％；正常苗根尖多倍化細(xì)胞占2.8％，二倍體比例為96.6％。結(jié)果表明：在胚狀體發(fā)生過(guò)程中，胚狀體和植株中變異細(xì)胞占的比例低于EC組織中的比例，培養(yǎng)物多倍化細(xì)胞較缺體高，二倍體細(xì)胞比例逐步增多，表明胚狀體和植株再生過(guò)程是一個(gè)對(duì)變異細(xì)胞的淘汰過(guò)程，在分化中二倍體細(xì)

9、胞具有某種選擇優(yōu)勢(shì)。同時(shí)試驗(yàn)中誘導(dǎo)5mo的紅核子龍眼EC已經(jīng)能見(jiàn)到染色體數(shù)目異常的細(xì)胞，變異率為8.6％，繼代3a后，變異率達(dá)10.0％，且繼代3a的松風(fēng)本、巨龍105的染色體數(shù)目變異率也分別在9.0％、9.8％，繼代13a的紅核子EC染色體變異率為15.0％。表明龍眼EC的在前期變異水平變化幅度可能較大，但長(zhǎng)期繼代過(guò)程中染色體數(shù)目變異逐步趨于穩(wěn)定。 5.龍眼限制生長(zhǎng)保存EC體胚發(fā)生過(guò)程及再生植株的RAPD分析 利用RA

10、PD技術(shù)從DNA分子水平對(duì)限制生長(zhǎng)保存后的龍眼EC體胚發(fā)生過(guò)程及其體胚發(fā)生再生植株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)。篩選了10條隨機(jī)引物，對(duì)龍眼EC體胚發(fā)生過(guò)程及其體胚發(fā)生再生植株基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果表明：龍眼體胚發(fā)生過(guò)程的RAPD分子標(biāo)記存在一定的差異，但不同保存年份EC體胚發(fā)生過(guò)程中的相對(duì)變異率都保持在比較小的變異范圍內(nèi)(小于5.1％)；同時(shí)利用RAPD-PCR隨機(jī)檢測(cè)3個(gè)保存時(shí)間的紅核子胚性培養(yǎng)物的再生完整植株的基因組DNA的差異，PCR