裂頭蚴河南不同地理株的蟲種鑒定、遺傳變異及抗原多肽基因的表達及鑒定.pdf

1、裂頭蚴?。╯parganosis）主要是由曼氏迭宮絳蟲(Spirometra mansoni)幼蟲-裂頭蚴(sparganum)感染而引起的一種嚴重的人獸共患寄生蟲病，該病呈世界性分布。裂頭蚴感染人體后，可在各種組織器官內移行引起炎癥反應，導致皮下包塊、失明、肢體麻痹、癲癇、甚至死亡。傳統(tǒng)的迭宮屬絳蟲的鑒別主要是通過形態(tài)學鑒定，而迭宮屬絳蟲的幼蟲階段缺乏形態(tài)學特征難以鑒別，因此，應用分子生物學方法對迭宮屬絳蟲幼蟲進行蟲種鑒定及遺傳變異分

2、析，對裂頭蚴病的防治具有重要意義。此外，裂頭蚴含有重復序列的抗原多肽（antigenic polypeptide，SAP，GenBank No.AB019222.1）可能是裂頭蚴的保護性抗原，對裂頭蚴的免疫逃避及其在宿主體內的長期寄生可能起著重要作用。
　　為了鑒定裂頭蚴河南不同地理株的蟲種、研究其遺傳變異與系統(tǒng)發(fā)育地位，本文從河南省6個地區(qū)（開封、鄭州、扶溝、新鄉(xiāng)、漯河、周口）自然感染的青蛙體內分離裂頭蚴，經口感染家貓后收集蟲卵

3、與成蟲進行形態(tài)學鑒定，選取曼氏迭宮絳蟲3個線粒體基因（cox1、cox3和nad4）作為分子標記，對河南6個地區(qū)的裂頭蚴進行了序列分析及遺傳變異分析。此外，本文還應用基因工程技術對裂頭蚴抗原多肽基因進行了克隆與表達，將純化后的重組蛋白免疫BALB/c小鼠獲得重組蛋白免疫血清，應用Westernblotting及間接免疫熒光試驗（IFA）發(fā)現(xiàn)裂頭蚴抗原多肽在曼氏迭宮絳蟲不同發(fā)育期的表達及其在蟲體組織的定位，并將其用于裂頭蚴感染小鼠血清的特

4、異性抗體的檢測，對裂頭蚴病的檢測提供新的候選抗原。
　　材料與方法:
　　1.裂頭蚴的采集與實驗動物感染:從河南省漯河、開封、鄭州、新鄉(xiāng)、通許、扶溝六地區(qū)自然感染青蛙體內分離裂頭蚴。將六地區(qū)分離出的裂頭蚴經口感染6只3月齡的無病原體家貓（10條/只），在感染后8～25天當中，每天使用自然沉淀法收集貓糞便中的蟲卵在顯微鏡下進行鑒定，感染后4周將貓剖殺，從貓小腸內收集成蟲并進行形態(tài)學鑒定。
　　2.幼蟲和成蟲目的基因的擴增

5、及序列分析:對曼氏迭宮絳蟲cox1、cox3和nad4三個線粒體基因進行PCR擴增，將純化后的PCR產物送北京金唯智生物公司進行雙向測序。首先使用Clustal X v2.0中的默認參數(shù)設置對3個基因序列進行比對然后在Se-Alv2.0a11中對比對序列進行校正。使用MEGA v5.0軟件進行遺傳距離分析。
　　3.系統(tǒng)發(fā)育分析:最后分別利用PAUP*4b10、PhyML v3.0和MrBayes v3.1軟件對cox1+cox3

6、+pnad4三基因聯(lián)合序列進行最大簡約法(MP)、最大似然法(ML)和貝葉斯法(BI)分析，并繪制曼氏迭宮絳蟲河南省6個地區(qū)分離株的系統(tǒng)發(fā)育樹。
　　4.裂頭蚴抗原多肽基因的克隆與表達:合成裂頭蚴抗原多肽基因，并在序列兩端添加酶切位點5' BamHⅠ和3'HindⅢ，保證在裂頭蚴抗原多肽基因序列中僅有BamHⅠ和HindⅢ2個酶切位點。將多肽基因克隆至載體pUC57-Kan。將目的基因雙酶切后亞克隆至表達載體pMAL-c2X，構建

7、重組質粒pMAL-c2X-SAP，轉化入大腸桿菌(Escherichiacoli) BL21，對重組質粒pMAL-c2X-SAP進行酶切鑒定，結果正確后用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達，收集菌體沉淀經超聲破碎后進行SDS-PAGE，觀察是否有抗原多肽蛋白的表達，并對表達產物進行可溶性分析。
　　5.裂頭蚴抗原多肽重組蛋白的鑒定:應用Amylose樹脂預裝柱對表達的裂頭蚴抗原多肽重組蛋白進行親和層析純化，將純化后的

8、重組蛋白免疫BALB/c小鼠，獲得重組蛋白免疫血清，通過Western blotting應用重組蛋白免疫血清對重組蛋白、裂頭蚴可溶性抗原及ES抗原進行識別。
　　將從自然感染蛙體與實驗感染鼠體內分離的裂頭蚴以及貓體內收集的成蟲進行石臘切片，應用IFA檢測裂頭蚴抗原多肽在曼氏迭宮絳蟲不同發(fā)育期蟲體的表達及其在蟲體組織的定位。應用重組蛋白與裂頭蚴ES蛋白分別用于檢測裂頭蚴感染小鼠及其他寄生蟲感染小鼠血清，觀察SAP-ELISA診斷裂頭

9、蚴病的敏感性與特異性。
　　結果:
　　1.蟲卵與成蟲的形態(tài)學鑒定:裂頭蚴經口感染貓后11天，在貓糞便中發(fā)現(xiàn)蟲卵;感染后4周從每只貓的小腸內檢出10條26～45厘米長的成蟲。蟲卵卵殼較薄、淺灰褐色、呈橢圓形，52～76微米長、31～44微米寬，且兩端稍尖、一端有卵蓋，內有一個卵細胞和若干個卵黃細胞?；谌缦滦螒B(tài)特征將收集的成蟲鑒定為曼氏迭宮絳蟲:頭節(jié)背、腹面各有一條縱行的吸槽，成節(jié)和孕節(jié)結構基本相似，肉眼可見每個節(jié)片中部凸起

10、的子宮。并且在節(jié)片中部依次有雄性生殖孔、雌性生殖孔和子宮孔三個開口。
　　2.裂頭蚴河南不同地理株的遺傳變異分析:鄭州、開封、通許、扶溝、新鄉(xiāng)、漯河6地區(qū)收集的裂頭蚴及其成蟲的cox1，cox3和nad4基因片段，均被成功擴增，其序列長度分別為417、390和578bp，且成蟲與幼蟲序列大小完全一致。cox1，cox3和nad4基因片段均富含AT堿基(AT含量分別為63.5％，68.3％和67％)，其序列變化范圍分別為0-4.4％

11、、0-0.8％和0-0.5％。
　　3.裂頭蚴河南不同地理株的系統(tǒng)發(fā)育分析:cox1，cox3和nad4序列的最適進化模型分別為TN93+I、HKY+G和HKY+I。對cox1+cox3+pnad4聯(lián)合序列分別采用最大簡約法、最大似然法和貝葉斯法的系統(tǒng)發(fā)育分析結果顯示，河南6個地區(qū)的裂頭蚴分離株與其他迭宮屬（Spirometra）絳蟲一起形成一個具有高支持值的單系分支（其自展值和后驗概率值分別為100、99和1.0），并與裂頭屬（

12、Diphyllobothrium）絳蟲分支互為姊妹類群。
　　4.裂頭蚴抗原多肽基因的克隆與表達:對重組質粒pMAL-c2X-SAP進行酶切鑒定，電泳后出現(xiàn)2條帶，1條帶為線性的pMAL-c2X(大小為6646 bp);另1條為783bp，與裂頭蚴抗原多肽的理論值大小相同，表明重組質粒pMAL-c2X-SAP構建成功。對重組質粒pMAL-c2X-SAP進行IPTG誘導表達，SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)在68.7 kDa處出現(xiàn)一條明顯的

13、蛋白帶(載體融合蛋白40 kDa+目的蛋白28.7 kDa)，表明重組蛋白表達成功，可溶性分析發(fā)現(xiàn)重組蛋白以可溶形式表達。
　　5.裂頭蚴抗原多肽重組蛋白的鑒定:Western blotting結果顯示，裂頭蚴抗原多肽重組蛋白可被裂頭蚴感染小鼠血清所識別;重組蛋白免疫血清可識別裂頭蚴可溶性抗原和ES抗原，在28.7kDa處有1條蛋白帶，表明裂頭蚴抗原多肽在裂頭蚴可溶性抗原和ES抗原均存在。IFA結果顯示，重組蛋白免疫血清與蛙體與鼠

14、體內的裂頭蚴均呈現(xiàn)陽性反應，蟲體皮層及內部組織均呈黃綠色熒光，但與成蟲則為陰性反應，蟲體呈橘紅色，表明裂頭蚴抗原多肽在裂頭蚴期表達，在成蟲期則不表達。SAP-ELISA和ES-ELISA檢測裂頭蚴感染小鼠血清抗體陽性率分別為83.8％(25/30)和100％(30/30)，SAP-ELISA的陽性率低于ES-ELISA(P＜0.05)。檢測弓形蟲、血吸蟲、旋毛蟲感染小鼠血清和正常小鼠血清均為陰性。
　　結論:
　　1.經形態(tài)

15、學及分子生物學鑒定，河南6個地區(qū)的裂頭蚴分離株均屬于曼氏迭宮絳蟲，cox1，cox3和nad4基因均能很好地揭示裂頭蚴各地理株線粒體之間的遺傳變異，且cox1的變異程度最高，cox3次之而nad4的變異程度最低。
　　2.成功構建了裂頭蚴抗原多肽的表達質粒pMAL-c2X-SAP，重組蛋白以可溶形式表達。Western blotting與IFA結果表明，裂頭蚴抗原多肽在裂頭蚴期表達，在裂頭蚴可溶性抗原和ES抗原均存在，定位于蟲體皮