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文檔簡介
1、新城疫病毒(NDV)是副黏病毒科副黏病毒亞科禽病毒屬的成員,是有囊膜的負鏈RNA病毒,可引起禽類的新城疫。我國經(jīng)過多年的綜合防制,現(xiàn)已基本控制了該病的流行。近年來,我國新城疫的發(fā)生出現(xiàn)新的特點,即非典型新城疫病例日益增多,高抗體雞群出現(xiàn)發(fā)病等。許多學者認為這可能與NDV毒株變異有關。開展NDV的病原研究和新型疫苗的開發(fā)顯的尤為重要。本研究對6株NDV分離株的F、HN基因的遺傳變異進行研究,目的是從分子水平上了解我國NDV流行毒株與疫苗毒
2、株的分子差異,探索新城疫疫苗免疫失敗的原因;采用生物信息學工具對NDV分離株的F蛋白的結(jié)構(gòu)與參考毒株進行了比較分析,目的為在核苷酸和氨基酸水平解釋NDV分離株生物學特性的變異提供依據(jù);克隆了NDV-F基因和雞的IL-2基因,構(gòu)建了雞新城疫核酸疫苗質(zhì)粒,旨在為預防NDV感染的輔助免疫提供理論基礎和技術支持。研究內(nèi)容如下: 1.應用RT-PCR方法對6個NDV分離株(ZD、JZ、XB、CA、ZZ、CC)的F基因主要功能區(qū)片段進行了擴
3、增,各擴增產(chǎn)物經(jīng)克隆、測序后與GenBank登錄的NDV參考毒株的F基因進行核苷酸及推導氨基酸序列分析。結(jié)果表明,6個NDV分離毒株間的F基因核苷酸和F蛋白氨基酸同源性分別在99.6%~99.9%和99.1%~99.8%之間;分離毒株與參考毒株F基因核苷酸和F蛋白氨基酸序列同源性分別在83.2%~87.3%和90.2%~93.8%之間;F蛋白裂解位點的氨基酸順序為112R-R-Q-K-R-F117,符合強毒株的分子特征;其F基因的分子特
4、性顯示6個分離株均屬基因Ⅶ型。研究結(jié)果提示,6個NDV分離株可能是同一毒株在傳播過程中發(fā)生的不同變異株。NDV分離株與臨床常用疫苗株的F基因同源性較低,在遺傳進化上親緣關系較遠,這可能是疫苗免疫雞群發(fā)病的重要原因之一。 2.應用RT-PCR方法對6個NDV分離株的HN基因進行了擴增,各擴增產(chǎn)物經(jīng)克隆、測序后與GenBank登錄的NDV參考毒株的HN基因進行了核苷酸及推導氨基酸序列分析。結(jié)果表明,6個NDV分離毒株間的HN基因核苷
5、酸和HN蛋白氨基酸同源性分別在98.7%~99.8%和98.1%~99.7%之間;分離毒株與參考毒株HN基因核苷酸HN蛋白氨基酸序列同源性分別在78.22%~85.3%和82.6%~90.0%之間;6個NDV分離株的HN蛋白均屬于HN571亞型,分離株與常用疫苗株的HN基因同源性較低。5個NDV分離株中的HN蛋白在538~540aa缺失潛在糖基化位點。 3.對NDV分離株ZD的F基因進行了序列測定,對其推導氨基酸序列與GenBa
6、nk登錄的NDV參考毒株的F蛋白序列進行了結(jié)構(gòu)分析。ZD株的F基因的開放閱讀框架編碼553個氨基酸的F蛋白。二級結(jié)構(gòu)分析后發(fā)現(xiàn),ZD株的F蛋白的α螺旋中心、β-折疊、轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的分布與JS-2-06株最為接近,與常規(guī)疫苗株La Sota、Clone-30、B1和V4等毒株相比,在124-167aa的α螺旋中心分為兩段,在377-386aa少一個β-折疊區(qū)域。對蛋白B細胞抗原表位、跨膜結(jié)構(gòu)分析后發(fā)現(xiàn),ZD株B細胞抗原表位4個參數(shù)共同
7、區(qū)的分布與F48E9、Mukteswar和JS-2-06相似。而比La Sota、Clone-30、Bl和V4株在110-117aa區(qū)段多一個共同區(qū)域。利用生物學軟件對ZD株F0蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)進行了預測。這為在核苷酸和氨基酸水平解釋NDV分離株生物學特性的變異提供了研究線索。 4.將NDV分離株的F基因成功地插入到pcDNA4/HisMax,構(gòu)建了新城疫核酸疫苗質(zhì)粒peDN.A4-F:將NDV的F基因和雞IL-2基因串聯(lián)插入
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