NDV分離株F及HN基因的遺傳變異分析與核酸疫苗質(zhì)粒的構(gòu)建.pdf

1、新城疫病毒(NDV)是副黏病毒科副黏病毒亞科禽病毒屬的成員，是有囊膜的負(fù)鏈RNA病毒，可引起禽類的新城疫。我國經(jīng)過多年的綜合防制，現(xiàn)已基本控制了該病的流行。近年來，我國新城疫的發(fā)生出現(xiàn)新的特點，即非典型新城疫病例日益增多，高抗體雞群出現(xiàn)發(fā)病等。許多學(xué)者認(rèn)為這可能與NDV毒株變異有關(guān)。開展NDV的病原研究和新型疫苗的開發(fā)顯的尤為重要。本研究對6株NDV分離株的F、HN基因的遺傳變異進(jìn)行研究，目的是從分子水平上了解我國NDV流行毒株與疫苗毒

2、株的分子差異，探索新城疫疫苗免疫失敗的原因；采用生物信息學(xué)工具對NDV分離株的F蛋白的結(jié)構(gòu)與參考毒株進(jìn)行了比較分析，目的為在核苷酸和氨基酸水平解釋NDV分離株生物學(xué)特性的變異提供依據(jù)；克隆了NDV-F基因和雞的IL-2基因，構(gòu)建了雞新城疫核酸疫苗質(zhì)粒，旨在為預(yù)防NDV感染的輔助免疫提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。研究內(nèi)容如下： 1.應(yīng)用RT-PCR方法對6個NDV分離株(ZD、JZ、XB、CA、ZZ、CC)的F基因主要功能區(qū)片段進(jìn)行了擴(kuò)

3、增，各擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)克隆、測序后與GenBank登錄的NDV參考毒株的F基因進(jìn)行核苷酸及推導(dǎo)氨基酸序列分析。結(jié)果表明，6個NDV分離毒株間的F基因核苷酸和F蛋白氨基酸同源性分別在99.6％～99.9％和99.1％～99.8％之間；分離毒株與參考毒株F基因核苷酸和F蛋白氨基酸序列同源性分別在83.2％～87.3％和90.2％～93.8％之間；F蛋白裂解位點的氨基酸順序為112R-R-Q-K-R-F117，符合強(qiáng)毒株的分子特征；其F基因的分子特

4、性顯示6個分離株均屬基因Ⅶ型。研究結(jié)果提示，6個NDV分離株可能是同一毒株在傳播過程中發(fā)生的不同變異株。NDV分離株與臨床常用疫苗株的F基因同源性較低，在遺傳進(jìn)化上親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這可能是疫苗免疫雞群發(fā)病的重要原因之一。 2.應(yīng)用RT-PCR方法對6個NDV分離株的HN基因進(jìn)行了擴(kuò)增，各擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)克隆、測序后與GenBank登錄的NDV參考毒株的HN基因進(jìn)行了核苷酸及推導(dǎo)氨基酸序列分析。結(jié)果表明，6個NDV分離毒株間的HN基因核苷

5、酸和HN蛋白氨基酸同源性分別在98.7％～99.8％和98.1％～99.7％之間；分離毒株與參考毒株HN基因核苷酸HN蛋白氨基酸序列同源性分別在78.22％～85.3％和82.6％～90.0％之間；6個NDV分離株的HN蛋白均屬于HN571亞型，分離株與常用疫苗株的HN基因同源性較低。5個NDV分離株中的HN蛋白在538～540aa缺失潛在糖基化位點。 3.對NDV分離株ZD的F基因進(jìn)行了序列測定，對其推導(dǎo)氨基酸序列與GenBa

6、nk登錄的NDV參考毒株的F蛋白序列進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析。ZD株的F基因的開放閱讀框架編碼553個氨基酸的F蛋白。二級結(jié)構(gòu)分析后發(fā)現(xiàn)，ZD株的F蛋白的α螺旋中心、β-折疊、轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的分布與JS-2-06株最為接近，與常規(guī)疫苗株La Sota、Clone-30、B1和V4等毒株相比，在124-167aa的α螺旋中心分為兩段，在377-386aa少一個β-折疊區(qū)域。對蛋白B細(xì)胞抗原表位、跨膜結(jié)構(gòu)分析后發(fā)現(xiàn)，ZD株B細(xì)胞抗原表位4個參數(shù)共同

7、區(qū)的分布與F48E9、Mukteswar和JS-2-06相似。而比La Sota、Clone-30、Bl和V4株在110-117aa區(qū)段多一個共同區(qū)域。利用生物學(xué)軟件對ZD株F0蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測。這為在核苷酸和氨基酸水平解釋NDV分離株生物學(xué)特性的變異提供了研究線索。 4.將NDV分離株的F基因成功地插入到pcDNA4/HisMax，構(gòu)建了新城疫核酸疫苗質(zhì)粒peDN.A4-F:將NDV的F基因和雞IL-2基因串聯(lián)插入