我國不同地區(qū)曼氏迭宮絳蟲裂頭蚴分離株的遺傳多態(tài)性研究.pdf

1、曼氏迭宮絳蟲是最重要的絳蟲種類之一，其幼蟲—裂頭蚴可以侵入人體皮下組織、腹腔、眼睛和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致一種嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲病——裂頭蚴病。人體感染裂頭蚴病主要是通過食入裂頭蚴感染的蛙肉或蛇肉，誤食感染有原尾蚴的劍水蚤，或用蛙肉、蛇肉（皮）敷貼皮膚的瘡癤、傷口或膿腫等。裂頭蚴病呈全球性分布，但大部分病例分布在東亞和東南亞國家。中國的裂頭蚴病例為世界之最，自1949年以來，在27個省、市、自治區(qū)已有1,000多例報道。近年來裂頭蚴病在我

2、國局部地區(qū)有增加的趨勢，在一些地區(qū)，裂頭蚴病已經(jīng)被列為新現(xiàn)的動物源性寄生蟲病。對于裂頭蚴的地理分布、種群遺傳特征與其生態(tài)環(huán)境之間的相互關(guān)系的了解，有助于裂頭蚴病的預(yù)防和控制。然而，目前有關(guān)裂頭蚴種群遺傳結(jié)構(gòu)的研究還十分薄弱。因此，有必要對我國不同地區(qū)裂頭蚴分離株進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析，從而有助于了解裂頭蚴種群變化及遺傳變異對其致病性的影響。
　　本研究首先對中國西南部9個不同地區(qū)野生蛙類的裂頭蚴自然感染情況進(jìn)行了調(diào)查。然后，基于4個分子

3、標(biāo)記（cytb、cox1、rrnS和28S rDNA D1）對這些裂頭蚴分離株的種群遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。在DNA多態(tài)性分析中，不同地區(qū)裂頭蚴分離株之間表現(xiàn)出了高度的遺傳多樣性和遺傳分化；系統(tǒng)發(fā)育推斷和中接網(wǎng)絡(luò)分析均支持西南地區(qū)裂頭蚴種群可分為兩個分枝。然而，中性檢驗、岐點(diǎn)分布分析和貝葉斯擴(kuò)張動力學(xué)曲線等分析均未發(fā)現(xiàn)西南地區(qū)裂頭蚴種群經(jīng)歷過擴(kuò)張。最后，本研究還對中國東部、中部、南部以及西南地區(qū)的裂頭蚴分離株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，認(rèn)為中國裂頭蚴

4、種群可能存在兩個類群（類群Ⅰ和類群Ⅱ），且這兩個類群在上新世中期開始分化。
　　材料與方法：
　　1.裂頭蚴的采集：在2013年5月到2014年9月之間，在我國西南部9個不同地區(qū)：四川（廣安、瀘州、綿陽、南充、南充營山）、云南（保山、德宏、昆明）及重慶（梁平）自然感染青蛙體內(nèi)分離裂頭蚴，放入5ml的凍存管中用無水乙醇保存并做好標(biāo)記。
　　2.目的基因的擴(kuò)增及測序：使用通用型柱式基因組提取試劑盒對每一個裂頭蚴分離株進(jìn)行基

5、因組DNA的提取，然后以基因組DNA為模板，使用PCR方法擴(kuò)增4個分子標(biāo)記：cytb、cox1、rrnS和28S rDNA D1，用PCR純化試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，將純化后的PCR產(chǎn)物送至金唯智公司進(jìn)行雙向測序，所有的序列均上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫。
　　3.序列比對及飽和度分析：首先使用Clustal X v.2.0程序?qū)€粒體基因編碼序列cytb和cox1進(jìn)行比對。然后根據(jù)其氨基酸序列在MEGA v.5.0中進(jìn)行校正。

6、對于線粒體核糖體rrnS基因和核糖體28S rDNA D1序列，首先預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)，然后根據(jù)二級結(jié)構(gòu)在MEGA v.5.0中進(jìn)行比對。使用DAMBE v5.2軟件對分子序列進(jìn)行核酸替代飽和性檢驗。此外，使用MEGA v.5.0來估算核苷酸組成、保守位點(diǎn)、變異位點(diǎn)、簡約信息位點(diǎn)等。
　　4.遺傳結(jié)構(gòu)分析：基于cytb、cox1、rrnS和28S rDNA D1的聯(lián)合序列，使用DnaSP v.5.10進(jìn)行單倍型（Haplotype）分

7、析，并計算每個種群的遺傳多態(tài)性。使用軟件Network v.4.5中的平均鄰接算法進(jìn)行單倍型網(wǎng)絡(luò)的重建?；诼?lián)合序列，使用MrBayes v.3.1來對西南地區(qū)裂頭蚴分離株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。基于聯(lián)合序列，在軟件Arlequin v.3.5.1.2中使用岐點(diǎn)分布分析評估裂頭蚴種群的動態(tài)變化。依據(jù)觀察到的和預(yù)測的錯配分布之間的偏差平方和與平滑指數(shù)評估擴(kuò)張模型的可靠性；同時，基于Fu’s FS檢測和Tajima’s D檢測進(jìn)行中性檢驗。同樣，

8、使用Arlequin v.3.5.1.2進(jìn)行分子差異度分析(AMOVA)，以檢測種群內(nèi)部和種群之間的遺傳多樣性水平。使用群體遺傳固定系數(shù)（Fst）值評估不同地理種群之間的遺傳差異水平。
　　5.系統(tǒng)發(fā)育分析：分別使用最大簡約法(maximum parsimony，MP)、最大似然法(maximum likelihood，ML)和貝葉斯推斷法(Bayesian inference，BI)對我國東部、中部、南部和西南地區(qū)裂頭蚴分離株進(jìn)

9、行系統(tǒng)發(fā)育分析。最大簡約法在MEGA v.5.0中進(jìn)行，系統(tǒng)樹每一分枝的置信度采用自引導(dǎo)法重復(fù)檢驗，設(shè)置1000次重復(fù)；使用PhyML軟件進(jìn)行最大似然分析；貝葉斯分析采用MrBayes v3.1軟件進(jìn)行；所有系統(tǒng)發(fā)育分析均運(yùn)算兩次。使用BEAST v1.6.1軟件，基于松弛分子鐘模型對cytb+cox1聯(lián)合數(shù)據(jù)集對我國不同地區(qū)裂頭蚴的分化時間進(jìn)行估算。
　　結(jié)果：
　　1.中國西南地區(qū)野生蛙類裂頭蚴自然感染率:從中國西南部9

10、個不同地區(qū)共采集野生蛙類276只，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定均為黑斑蛙（Rana nigromaculata）。在276只黑斑蛙中，55只發(fā)現(xiàn)有裂頭蚴寄生，平均感染率為19.93％。西南不同地區(qū)野生黑斑蛙體內(nèi)裂頭蚴的感染率從8.33%到50.00%不等，最多的1只蛙體內(nèi)可有31條裂頭蚴寄生，最少的每只蛙有1條裂頭蚴感染。四川地區(qū)蛙類裂頭蚴的感染率高于其他地區(qū)，其中，四川南充地區(qū)黑斑蛙蛙的裂頭蚴感染率最高，達(dá)到50.00%，感染強(qiáng)度為每只蛙有1~23條

11、裂頭蚴感染。
　　2.裂頭蚴DNA序列多態(tài)性：4個目的基因（cytb、cox1、rrns和28S rDNA D1）均得到成功擴(kuò)增，其長度分別為1110 bp、1566 bp、280 bp和299 bp，且這些序列均未出現(xiàn)飽和現(xiàn)象，表明其適用于系統(tǒng)發(fā)育研究。4個基因聯(lián)合序列（cytb+cox1+rrnS+28S）共鑒定出180個多態(tài)位點(diǎn)，其中161個是簡約性信息位點(diǎn)，有19個是單一變異位點(diǎn)；在來自9個不同地理區(qū)域的52個裂頭蚴地理株

12、中，共鑒定出32個單倍型。每一地理種群及整個裂頭蚴種群均具有較高的單倍型多態(tài)性。
　　3.西南地區(qū)裂頭蚴種群遺傳結(jié)構(gòu)：分子差異度分析(AMOVA)的結(jié)果顯示裂頭蚴種群之間的遺傳差異度為57.31%，比種群內(nèi)的(42.69%)要高一些。除了四川廣安和四川綿陽之間及四川廣安和四川南充之間的Fst值小于0.25以外，其他地區(qū)之間的群體遺傳固定系數(shù)值均在0.25以上。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示我國西南地區(qū)裂頭蚴分離株可分為兩個主要的分枝（分枝Ⅰ和分枝

13、Ⅱ）?；趩伪缎吐?lián)合序列的中接鄰接網(wǎng)絡(luò)分析的結(jié)果同樣顯示，我國西南地區(qū)的裂頭蚴存在兩個單倍型子網(wǎng)絡(luò)。基于寬松分子鐘模型的分化時間估算表明，我國西南地區(qū)的裂頭蚴分離株在上新世中期（2.91 Myr）開始分化。分枝Ⅰ的起源時間大約在上新世晚期（1.88 Myr），分枝Ⅱ在更新世早期（1.56Myr）開始分化。岐點(diǎn)分布分析結(jié)果顯示，分枝Ⅰ、分枝Ⅱ及整個種群的分布曲線均呈多峰分布狀態(tài)，表明西南地區(qū)種群處于平衡階段。貝葉斯擴(kuò)張動力學(xué)曲線分析的結(jié)果

14、同樣不支持枝Ⅰ、分枝Ⅱ及整個種群存在明顯的種群擴(kuò)張。
　　4．系統(tǒng)發(fā)育分析及分化時間估算：我國裂頭蚴種群可分為兩個主要類群：類群Ⅰ和類群Ⅱ，且這兩個種群在上新世中期開始分化。所有來自河南、湖南、安徽、浙江及重慶的裂頭蚴分離株均包含在類群Ⅰ中，類群Ⅰ大約在1.67 Myr（上新世晚期）開始分化。類群Ⅱ包含的裂頭蚴分離株主要來自云南、海南和廣西，此類群的起源時間被估算為上新世晚期（1.89Myr）。來自貴州、江蘇和四川的分離株在兩個分

15、枝中均有分布。
　　結(jié)論：
　　1. DNA多態(tài)性分析結(jié)果顯示我國西南不同地區(qū)裂頭蚴種群的遺傳多態(tài)性及遺傳差異均比較高；基于多基因聯(lián)合序列（cytb、cox1、rrnS和28S rDNA D1）的系統(tǒng)發(fā)育推斷及中接鄰接網(wǎng)絡(luò)分析均表明我國西南地區(qū)的裂頭蚴種群可分為兩個主要分枝。
　　2.對我國東部、中部、南部和西南地區(qū)的裂頭蚴分離株進(jìn)行的系統(tǒng)發(fā)育分析及分化時間估算結(jié)果表明，我國的裂頭蚴種群可以分為類群Ⅰ和類群Ⅱ兩個主要類