Wnt5a-JNK信號及γ-catenin在CML中的作用機制研究.pdf

1、目的:
　　Wnt信號與腫瘤的關系一直是國際研究熱點。我們前期研究表明Wnt5a在白血病中是一種腫瘤抑制因子;并且Wnt5a與Ror2受體結合,激活非經(jīng)典Wnt信號,并抑制經(jīng)典信號及β-catenin的促癌功能。但Wnt5a是通過什么關鍵分子拮抗經(jīng)典Wnt信號?它們是否也影響了CML的特效藥物Imatinib Mesylate(甲磺酸伊馬替尼)對CML的抑制作用?目前國內(nèi)外均未見報道,值得深入研究。
　　已有報道,在某些細胞

2、中Wnt5a可與細胞膜上Ror2、Fz受體分子結合,并激活JNK,即激活Wnt5a/JNK非經(jīng)典Wnt信號通路。在CML細胞中,對JNK的研究目前很有限,并有不同的結論:早期的研究認為BCR-ABL激活JNK,并且后者參與了BCR-ABL介導的轉(zhuǎn)化;另一方面,JNK參與了一些化合物誘導BCR-ABL陽性CML細胞凋亡的過程。在CML細胞中,Wnt5a是否可激活JNK,JNK是否參與了Wnt5a對Imatinib Mesylate抗白血病

3、的促進作用?其機制又是什么?這些問題需要我們的進一步證明。
　　γ-catenin是Armadillo蛋白家族(包括α-catenin、β-catenin和γ-catenin)的一個成員,在細胞中它主要參與粘附作用與信號轉(zhuǎn)導。γ-catenin作為Wnt信號通路的一員,它與Wnt5a的關系如何?它是否也參與了Wnt5a對ImatinibMesylate抗白血病的作用?這些目前國內(nèi)外均未見報道,值得深入研究。在血液腫瘤中,以前的研究

4、表明,AML(AcuteMyeloidLeukemia,急性髓系白血病)融合基因AML1-ETO,PML-RARα和PLZF-RARα所表達的蛋白均可促進γ-catenin的表達,但是CML細胞中的融合基因BCR-ABL所表達的蛋白是否調(diào)節(jié)γ-catenin的表達還未見報道。Kim等的研究發(fā)現(xiàn):相對于CML慢性期的病人,加速期與急變期的病例中γ-catenin高表達,提示γ-catenin在CML中可能發(fā)揮重要作用,但確切的作用及其機制

5、尚需深入研究。
　　本研究在前期研究的基礎上,以解決以下幾個問題為目的:1.Wnt5a是否可通過激活JNK影響Imatinib Mesylate的抗白血病作用?2.γ-catenin是否可以被Wnt5a調(diào)節(jié)?3.γ-catenin是否可以被BCR-ABL調(diào)節(jié),并且在CML中發(fā)揮什么作用?并且γ-catenin是否也能夠影響ImatinibMesylate的抗白血病作用?研究結果有助于深入認識Wnt5a/JNK與γ-catenin在

6、白血病中的作用及機制,為臨床治療CML提供新的策略。
　　方法:
　　1.Wnt5a通過JNK影響Imatinib Mesylate抑制CML細胞作用及其機制研究。
　　1.1.構建過表達Wnt5a的細胞株(KU812-Wnt5a);Wnt5a在CML細胞中對β-catenin及其下游基因Survivin表達的影響,以及對γ-catenin表達水平的影響;檢測過表達Wnt5a對ImatinibMesylate抑制CML

7、細胞株(K562,KU812)的影響(抑制CML細胞增殖,誘導CML細胞凋亡,抑制BCR-ABL表達及活性)。
　　1.2.檢測過表達Wnt5a對JNK表達及其活性(磷酸化水平)的影響;JNK受到抑制后Wnt5a對β-catenin/Survivin表達的影響;使用JNK抑制劑SP600125抑制JNK活性,然后檢測ImatinibMesylate抑制細胞株K562-Wnt5a、KU812-Wnt5a的變化。
　　1.3.構

8、建過表達JNK1與JNK2的CML細胞株,檢測JNK對ImatinibMesylate抑制CML細胞株的影響,以及對β-catenin及其下游基因Survivin表達的影響,以及對γ-catenin表達水平的影響。
　　1.4.構建K562細胞NOD/SCID鼠移植瘤模型;檢測Wnt5a在體內(nèi)對ImatinibMesylate抑制成瘤生長的影響以及對BCR-ABL表達的影響。
　　2.γ-catenin在CML中作用的研究<

9、br>　　2.1.檢測不同白血病細胞株中γ-catenin的表達情況;構建BCR-ABLsiRNA的CML細胞株,檢測BCR-ABL對γ-catenin表達的影響;用免疫共沉淀的方法檢測蛋白BCR-ABL與γ-catenin的相互作用。
　　2.2.構建γ-cateninsiRNA的CML細胞株;檢測γ-catenin受到抑制后CML細胞增殖及克隆形成的變化,以及細胞增殖有關的基因cycliD1及c-Myc表達的變化。
　　

10、2.3.檢測抑制γ-catenin對ImatinibMesylate抑制CML細胞株(抑制增殖,誘導凋亡)的影響,以及基因Survivin、Bcl-xL表達的變化。
　　2.4.檢測γ-catenin受到抑制后核轉(zhuǎn)錄因子STAT5磷酸化水平的變化,β-catenin表達水平及磷酸化水平以及核轉(zhuǎn)位情況,以及Wnt信號中調(diào)節(jié)β-catenin的關鍵分子GSK3β及其磷酸化水平的變化。
　　結果:
　　1.Wnt5a/JNK

11、信號通路促進了ImatinibMesylate對CML細胞的抑制作用;并且Wnt5a可以抑制γ-catenin的表達,但并不是通過JNK。
　　1.1.在過表達Wnt5a的細胞株中發(fā)現(xiàn):Wnt5a抑制了β-catenin及其下游基因Survivin,也抑制了γ-catenin的表達;Wnt5a可促進ImatinibMesylate對CML細胞株增殖的抑制,增強其誘導凋亡的能力,并促進ImatinibMesylate抑制BCR-AB

12、L融合基因表達及抑制其活性的能力。
　　1.2.Wnt5a對JNK表達水平無影響,但能活化JNK(磷酸化水平升高);用JNK抑制劑SP600125抑制JNK活性后,削弱了Wnt5a對ImatinibMesylate抗白血病的增強作用,也削弱了Wnt5a對β-catenin及其下游基因Survivin的抑制。
　　1.3.在過表達JNK1與JNK2的CML細胞株中發(fā)現(xiàn):JNK促進了對ImatinibMesylate抑制CML細

13、胞株的作用;JNK1/JNK2均抑制了β-catenin及其下游基因Survivin,但對γ-catenin沒有影響。
　　1.4.成功構建K562細胞NOD/SCID鼠移植瘤模型;Wnt5a在體內(nèi)增強了ImatinibMesylate對移植瘤生長和BCR-ABL表達的抑制。
　　2.γ-catenin在CML中作用的研究
　　2.1.在7個白血病細胞株中,γ-catenin只在K562、KU812兩個CML細胞中表達

14、;構建成功BCR-ABLsiRNA的CML細胞株,并且發(fā)現(xiàn)BCR-ABL表達下降后γ-catenin表達也下降;免疫共沉淀結果顯示BCR-ABL蛋白與γ-catenin并未像BCR-ABL與β-catenin一樣相互結合。
　　2.2.構建成功γ-cateninsiRNA的CML細胞株;并且發(fā)現(xiàn)抑制γ-catenin時,CML細胞增殖減慢,克隆形成能力也降低,與細胞增殖有關的基因cyclinD1及c-Myc表達均下降。
　　

15、2.3.抑制γ-catenin后,ImatinibMesylate對CML細胞株的抑制作用(抑制增殖,誘導凋亡)增強;凋亡相關基因Survivin、Bcl-xL表達下降。
　　2.4.抑制γ-catenin后核轉(zhuǎn)錄因子STAT5磷酸化水平下降;GSK3β表達水平上升,而磷酸化水平下降;總β-catenin表達水平無明顯變化,但其磷酸化水平升高,且核內(nèi)β-catenin蛋白水平下降。
　　結論:
　　1.在CML中,Wn

16、t5a可活化JNK,并通過JNK促進藥物ImatinibMesylate的作用,其機制與其抑制β-catenin及其下游基因Survivin表達有關。Wnt5a還能抑制Wnt相關分子γ-catenin,但與JNK無關,該作用也是Wnt5a增強ImatinibMesylate抑制CML的作用機制之一。
　　2.在CML中,γ-catenin高表達,這與BCR-ABL上調(diào)γ-catenin有關,這種調(diào)節(jié)不是二者直接結合的方式。下調(diào)γ-