Wnt2-β-catenin信號(hào)通路在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中作用的研究.pdf

1、食管鱗癌是發(fā)展中國(guó)家尤其是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,具有高復(fù)發(fā)率和低生存率的特征。雖然隨著各種治療措施的改進(jìn)使其預(yù)后有了明顯提高,但截至目前為止,食管鱗癌在分子水平上的發(fā)生機(jī)制仍未徹底闡明。臨床前期和臨床期的諸多資料表明,食管鱗癌的早期發(fā)現(xiàn)對(duì)食管鱗癌患者的預(yù)后極其重要。從分子水平上闡述食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,將會(huì)有助于發(fā)現(xiàn)食管鱗癌治療的潛在靶點(diǎn)從而提高和改善食管癌患者的生存率和預(yù)后。
　　 編碼多功能糖蛋白的Wnt基因家族參與調(diào)

2、節(jié)人體各種病理生理過(guò)程,包括細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育及腫瘤發(fā)生。而作為Wnt/β-catenin信號(hào)通路樞紐分子的β-連環(huán)蛋白(β-catenin)參與細(xì)胞內(nèi)兩個(gè)獨(dú)立的過(guò)程,即細(xì)胞粘附和Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。正常情況下,大部分β-catenin與上皮鈣粘蛋白(E-cadherin)粘附連接在胞膜上,只有極少部分存在于細(xì)胞質(zhì)中,胞質(zhì)內(nèi)β-catenin水平受蛋白降解復(fù)合體所調(diào)控,使β-catenin磷酸化從而被泛素蛋白酶體系統(tǒng)降解。然而一旦Wnt蛋白

3、與受體Frz結(jié)合,就可使胞質(zhì)內(nèi)散亂蛋白(Dsh)激活而被磷酸化,磷酸化的Dsh與APC結(jié)合抑制GSK3β活性,從而導(dǎo)致β-catenin不能被磷酸化。作為轉(zhuǎn)錄激活子的β-catenin從胞質(zhì)進(jìn)入胞核與核內(nèi)TCF4/LEF1結(jié)合元件的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合從而激活下游靶基因如c-my、cyclin D1、survivin、c-jun等的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。
　　 越來(lái)越多的證據(jù)表明,Wnt2/β-catenin信號(hào)通路的失調(diào)和紊亂與人類多種腫瘤發(fā)生

4、密切相關(guān)。目前有關(guān)Wnt2/β-catenin通路在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道。而抑制β-catenin的藥物和單克隆抗體也已廣泛地應(yīng)用于治療人類多種惡性腫瘤并取得了一定的效果。本研究中,β-catenin siRNA被用來(lái)抑制食管鱗癌細(xì)胞內(nèi)β-catenin的表達(dá),觀察其對(duì)食管鱗癌細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響,從而進(jìn)一步闡述β-catenin在食管鱗癌癌變過(guò)程中可能的機(jī)制和作用。
　　 硝普鈉(SNP)作為一氧化氮(N

5、O)釋放劑,具有廣泛的生物學(xué)活性,參與調(diào)節(jié)機(jī)體多種生理活動(dòng)。研究發(fā)現(xiàn),NO不僅參與與細(xì)胞增殖分化的調(diào)節(jié),而且還可促進(jìn)細(xì)胞周期的捕獲和細(xì)胞凋亡。而作為心血管擴(kuò)張劑應(yīng)用于臨床的硝普鈉在腫瘤發(fā)生過(guò)程中與β-catenin之間潛在的抑制作用的機(jī)制仍有爭(zhēng)議。盡管炎性調(diào)節(jié)因子NO和激活的β-catenin之間關(guān)系的證據(jù)不斷增多,但在食管鱗癌中SNP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是否通過(guò)降低β-catenin表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)尚未見(jiàn)報(bào)道。因此,本研究中我們同時(shí)觀察硝普鈉和β-

6、catenin siRNA對(duì)食管鱗癌Eca109和EC9706細(xì)胞細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響。
　　 本研究通過(guò)檢測(cè)Wnt2及其下游靶基因在食管鱗癌組織中的表達(dá)情況,分析它們與腫瘤發(fā)生部位、組織學(xué)分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及五年生存率之間的關(guān)系;采用半定量RT-PCR和Western blots法檢測(cè)人食管鱗癌細(xì)胞中Wnt2及其下游靶基因mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況。此外,利用新型CCK-8試劑盒檢測(cè)瞬時(shí)表達(dá)硝普鈉和β-caten

7、in siRNA對(duì)Eca109和EC9706細(xì)胞增殖的影響,通過(guò)半定量RT-PCR和Western blots檢測(cè)硝普鈉和β-catenin siRNA處理前后的食管鱗癌細(xì)胞株中與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)的基因β-catenin、c-myc和cyclin D1表達(dá)水平的變化,進(jìn)一步探討β-catenin siRNA作為潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)的分子機(jī)理。最后利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)硝普鈉和β-catenin siRNA處理前后對(duì)食管鱗癌細(xì)胞細(xì)胞周期以及細(xì)胞

8、凋亡的影響。
　　 總之,本研究探討了Wnt2/β-catenin信號(hào)通路在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用,有助于加深人們對(duì)食管鱗癌癌變分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)和了解,為利用β-catenin作為分子靶點(diǎn)的腫瘤基因治療提供了新的思路,對(duì)硝普鈉與Wnt2/β-catenin信號(hào)通路的相互作用關(guān)系的研究將為今后開(kāi)發(fā)出更多選擇性強(qiáng)、高效低毒的靶向藥物提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),并最終為分子水平治療食管鱗癌奠定了理論基礎(chǔ)。
　　 材料與方法
　　

9、1食管鱗癌Eca109及EC9706細(xì)胞中Wnt2/β-catenin信號(hào)通路激活狀態(tài)研究
　　 為了探討Wnt2/β-catenin通路在食管鱗癌Eca109及EC9706細(xì)胞中是否激活,我們采用細(xì)胞免疫化學(xué)法、RT-PCR和Western blots法檢測(cè)Wnt2、β-catenin、c-myc和cyclin D1 mRNA及蛋白的表達(dá)水平。
　　 2人食管鱗癌組織、癌旁組織及食管正常組織中Wnt2、β-cateni

10、n、c-myc和cyclinD1的表達(dá)情況
　　 40例食管鱗癌患者新鮮蠟塊標(biāo)本取自于2001～2006年安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院住院病人,所有患者手術(shù)前均未接受過(guò)放化療且手術(shù)標(biāo)本均無(wú)壞死腫瘤組織,每份標(biāo)本中均含癌組織,癌旁組織及正常組織。臨床及病理資料來(lái)自病人醫(yī)學(xué)檔案記錄?；颊吣挲g45～74歲(中位年齡60.95歲),其中女性18人,男性22人。腫瘤組織呈高分化6例,中分化19例,低分化15例。手術(shù)切除標(biāo)本經(jīng)10％甲醛固定,石蠟包埋,用

11、于免疫組織化學(xué)分析的標(biāo)本被切成4μm厚切片,其中一張用于HE染色來(lái)確定其病理組織學(xué)類型,其余切片則用于免疫組織化學(xué)分析。
　　 首先將切片在二甲苯中脫蠟三次,每次5 min,然后置于梯度酒精中(梯度分別為100、90、80、70％)。為了加強(qiáng)抗原修復(fù)效果,切片放于微波爐中加熱10 min后放入盛有枸櫞酸鹽的緩沖液中,高壓修復(fù)20 min。為了阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,每張切片在3％H2O2的甲醇中室溫下放置30 min,PBS洗5

12、min×3次。切片和10％封閉用正常兔血清在室溫下孵育20 min,4℃放置過(guò)夜后再與1:100稀釋的一抗4℃過(guò)夜,然后加入生物素化二抗工作液,37℃濕盒內(nèi)孵育30min,最后加入辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液,37℃濕盒繼續(xù)孵育10 min,將DAB底物工作液滴加在切片上,顯微鏡下控制顯色,用自來(lái)水終止顯色反應(yīng)并拍照。
　　 3不同濃度的硝普鈉作用Eca109及EC9706細(xì)胞后對(duì)Wnt2/β-catenin信號(hào)通路的影響

13、>　　 3.1細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)分析硝普鈉對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖的影響
　　 采用CCK-8試劑盒檢測(cè)硝普鈉對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖的影響。首先將不同濃度硝普鈉處理的Eca109及EC9706細(xì)胞以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板,37℃培養(yǎng)24 h后每孔加入50μl用培養(yǎng)基稀釋的不同濃度梯度硝普鈉混懸液,最后加入含10％CCK-8的新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h后用酶標(biāo)儀測(cè)450 nm的吸光度。
　　 3.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)硝普

14、鈉對(duì)食管鱗癌細(xì)胞中Wnt2、β-catenin、c-myc和cyclin D1 mRNA的影響
　　 根據(jù)操作說(shuō)明采用SYBR Green法進(jìn)行PCR定量檢測(cè)。先用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA,然后采用AMV First Strand DNA Synthesis試劑盒合成cDNA第一鏈,PCR反應(yīng)體系如下:0.5μl cDNA,0.5 U LA Taq DNA聚合酶,2.5μl10×LAPCR緩沖液,2.5 mM dNTP混

15、合物和各50 pM正向和反向引物,Actin作為對(duì)照。PCR反應(yīng)條件為:預(yù)變性95℃5 min,然后95℃40 s,不同基因采用適宜的退火溫度退火40 s,72℃50 s,總共35個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增結(jié)束后,取10μl樣品進(jìn)行電泳檢測(cè),并用Gene Tools進(jìn)行mRNA相對(duì)表達(dá)量分析。
　　 3.3 Western blots分析硝普鈉對(duì)食管鱗癌細(xì)胞中Wnt2、β-catenin、c-myc和cyclinD

16、1蛋白的影響
　　 將不同濃度硝普鈉處理后的Eca109和EC9706細(xì)胞在裂解緩沖液中進(jìn)行裂解,12,000 rpm/min離心5 min收集細(xì)胞裂解產(chǎn)物,蛋白濃度采用Bradford法進(jìn)行測(cè)定。20μg總蛋白在1×SDS緩沖液中煮5 min,通過(guò)10％SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,硝酸纖維素膜先用含5％脫脂奶粉的PBST在室溫下封閉2 h,然后分別加入一抗(Wnt2、β-catenin、c-myc、cyclin

17、D1和β-actin)并用含1％脫脂奶粉的PBST進(jìn)行稀釋,加入羊抗(或兔抗或鼠抗)連接辣根過(guò)氧化物酶的二抗,最后用DAB進(jìn)行曝光顯影,并用Gene Tools進(jìn)行蛋白相對(duì)表達(dá)量的分析。
　　 3.4硝普鈉對(duì)細(xì)胞周期的影響
　　 1×106個(gè)不同濃度硝普鈉處理后的Eca109及EC9706細(xì)胞培養(yǎng)24 h后收獲并在PBS緩沖液中漂洗,然后在70％的冰乙醇中4℃固定30 min。冷PBS漂洗三次,細(xì)胞重懸于含40μg PI

18、和100μg RNaseA的PBS溶液中,37℃孵育30 min后通過(guò)流式細(xì)胞儀分析樣品中DNA的含量。
　　 3.5硝普鈉對(duì)細(xì)胞凋亡的影響
　　 將1 mM和2 mM硝普鈉處理后的Eca109及EC9706細(xì)胞培養(yǎng)48 h用胰蛋白酶進(jìn)行預(yù)處理,PBS漂洗后,加入5μl Annexin V-FITC和2.5μl PI至100μl的細(xì)胞懸液中,并在暗室中進(jìn)行混勻和孵育15 min,最后把400μl結(jié)合緩沖液加入到混合物中進(jìn)

19、行流式細(xì)胞分析。
　　 4β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染食管鱗癌細(xì)胞后對(duì)β-catenin信號(hào)通路的影響
　　 4.1半定量RT-PCR檢測(cè)β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染后β-catenin、c-myc和cyclin D1mRNA的變化
　　 根據(jù)操作說(shuō)明用Trizol試劑提取總RNA,然后用AMV First Strand DNASynthesis試劑盒合成cDNA第一鏈。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:預(yù)變性

20、95℃5 min,然后95℃40 s,不同基因按適宜的退火溫度退火40 s,72℃50 s,總共35個(gè)循環(huán),最后在72℃延伸10 min。擴(kuò)增后取10μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè),并用GoneTools進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量的分析。
　　 4.2 Western blots分析β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染后β-catenin、c-myc和cyclin D1蛋白的變化
　　 將β-catenin siRNA處理前后的食管鱗癌

21、細(xì)胞在裂解液中進(jìn)行裂解。12,000rpm/min離心5 min后收集細(xì)胞裂解物,通過(guò)10％SDS-PAGE電泳電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上,硝酸纖維素膜先用含有脫脂奶粉的PBST封閉,然后分別加一抗(Wnt2、β-catenin、C-myc、cyclin D1和β-actin),再加入鼠抗(羊抗或兔抗)連接的辣根過(guò)氧化物酶的二抗,最后用DAB進(jìn)行顯影曝光。
　　 4.3β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)食管鱗癌細(xì)胞周期的影響

22、　　 1×106個(gè)β-catenin-siRNA處理后的Eca109及EC9706細(xì)胞培養(yǎng)24h后收獲,用0.2％胰蛋白酶消化,然后在70％的冰乙醇中4℃固定30 min后過(guò)夜。上機(jī)前用冷PBS漂洗三次,細(xì)胞重懸于含有40μgPI和100μg RNase A的PBS細(xì)胞懸液中,37℃孵育30 min后通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)樣品中的DNA含量。
　　 4.4β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)食管鱗癌細(xì)胞凋亡的影響
　　 將

23、β-catenin siRNA處理后的Eca109及EC9706細(xì)胞培養(yǎng)48h后用胰蛋白酶進(jìn)行處理,并用PBS進(jìn)行漂洗,將終濃度1μg/ml Annexin V-FITC和250ng PI加入到含有細(xì)胞懸浮液和結(jié)合緩沖夜的混合物中,并在暗室中進(jìn)行混勻和孵育15 min,然后取400μl的結(jié)合液加入到混合物中進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)。
　　 5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 RT-PCR和Western blots結(jié)果均采用Gene Tools

24、軟件進(jìn)行灰度值分析,上述試驗(yàn)均分別重復(fù)三次。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理均采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件,統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA),P<0.05表示差異具有顯著性。
　　 結(jié)果：
　　 1 Wnt2/β-catenin信號(hào)通路在食管鱗癌組織和細(xì)胞中的異常激活
　　 細(xì)胞免疫化學(xué)結(jié)果表明,食管鱗癌Eca109和EC9706細(xì)胞中Wnt2和β-catenin均呈現(xiàn)陽(yáng)性表

25、達(dá)。
　　 半定量RT-PCR分別擴(kuò)增出Wnt2、β-catenin、c-myc和cyclin D1 mRNA且人食管鱗癌EC9706細(xì)胞中Wnt2、β-catenin、c-myc和cyclin D1 mRNA的表達(dá)明顯高于Eca109細(xì)胞中的表達(dá),二者在表達(dá)量上具有顯著性差異(P<0.05)。
　　 Western blots法檢測(cè)食管鱗癌細(xì)胞中Wnt2、β-catenin、c-myc和cyclin D1的表達(dá)情況,發(fā)

26、現(xiàn)食管鱗癌細(xì)胞株EC9706細(xì)胞中Wnt2、β-catenin、c-myc和cyclinD1的蛋白表達(dá)明顯高于Eca109細(xì)胞,二者在表達(dá)量上具有顯著性差異(P<0.05)。
　　 2 Wnt2、β-catenin、c-myc和cyclin D1蛋白在食管鱗癌組織、癌旁組織和食管正常組織中的表達(dá)
　　 采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)40例人食管鱗癌組織、癌旁組織以及食管正常組織中Wnt2、β-catenin、c-myc和cycl

27、in D1的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,Wnt2在食管鱗癌組織、癌旁組織及食管正常組織中陽(yáng)性表達(dá)百分率依次為27.5％(11/40)、12.5％(5/40)和5.0％(2/40);β-catenin減弱的細(xì)胞膜表達(dá)在食管鱗癌組織、癌旁組織及食管正常組織中百分率依次為55.0％(22/40)、10.0％(4/40)和2.5％(1/40)；c-myc在食管鱗癌組織、癌旁組織及食管正常組織中陽(yáng)性表達(dá)百分率依次為52.5％(21/40)、7.5％(3/

28、40)和2.5％(1/40);cyclin D1在食管鱗癌組織、癌旁組織及食管正常組織中陽(yáng)性表達(dá)百分率依次為32.5％(13/40)、7.5％(3/40)和0％(0/40),且兩兩組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Wnt2、β-catenin、c-myc和cyclin D1在食管正常組織、癌旁組織及食管鱗癌組織中表達(dá)水平依次升高,即隨著食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展Wnt2、β-catenin、c-myc和cyclin D1的異常表達(dá)率逐漸升高(P<0.

29、01)。
　　 β-catenin降低的膜表達(dá)和c-myc陽(yáng)性表達(dá)明顯地與浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05),而與腫瘤的分化程度及分期無(wú)相關(guān)性(P>0.05);Wnt2和cyclin D1的陽(yáng)性表達(dá)率與腫瘤的分化程度及分期,浸潤(rùn)深度及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。
　　 具有β-catenin降低膜表達(dá)(P=0.031)和c-myc陽(yáng)性表達(dá)(P=0.008)患者的五年生存率明顯降低提示預(yù)后較差,而Wnt

30、2及cyclin D1陽(yáng)性及陰性表達(dá)患者的五年生存率之間則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 3硝普鈉對(duì)Wnt2/β-catenin信號(hào)通路作用的相關(guān)分子機(jī)制研究
　　 3.1硝普鈉對(duì)人食管鱗癌Eca109和EC9706細(xì)胞增殖的影響
　　 用不同濃度硝普鈉處理Eca109及EC9706細(xì)胞后食管鱗癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖速率明顯減慢(P<0.05),而且在一定范圍內(nèi)抑制作用隨硝普鈉濃度增加而加強(qiáng),結(jié)果表明,一定濃度的硝普鈉能抑制食管

31、鱗癌細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖。
　　 3.2硝普鈉對(duì)Wnt2/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)因子mRNA和蛋白表達(dá)的變化
　　 與硝普鈉處理前的Eca109及EC9706細(xì)胞相比,1 mM和2 mM硝普鈉處理后的Eca109及EC9706細(xì)胞中的Wnt2和cyclinD1 mRNA的表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化(P>0.05)。而同樣方式處理的細(xì)胞中β-catenin和c-myc mRNA的表達(dá)水平則明顯下調(diào)(P<0.05)。在三個(gè)獨(dú)立

32、的實(shí)驗(yàn)中,與硝普鈉未處理組相比,1 mM和2 mM硝普鈉處理后的Eca109及EC9706細(xì)胞中的β-catenin和c-myc的蛋白表達(dá)水平均明顯下調(diào)(P<0.05),而同樣方式處理的Eca109及EC9706細(xì)胞中的Wnt2和cyclinD1的蛋白表達(dá)水平均沒(méi)有明顯改變(P>0.05)。
　　 3.3硝普鈉對(duì)食管鱗癌細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響
　　 1 mM和2 mM硝普鈉作用Eca109和EC9706細(xì)胞后G0/G1

33、期的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別是72.4％、76.1％和76.4％、77.4％,與硝普鈉未處理組相比,2 mM硝普鈉作用于Eca109和EC9706細(xì)胞后S期的比率分別從16.6％上升到34.2％和從11.3％上升到12.8％,表明硝普鈉激活Wnt2/β-catenin信號(hào)通路導(dǎo)致DNA的合成受阻。不同濃度的硝普鈉作用食管鱗癌細(xì)胞后在C0/G1期細(xì)胞比率增加及在S期細(xì)胞比率降低提示硝普鈉能促進(jìn)細(xì)胞周期捕獲。此外,1 mM和2 mM的硝普鈉作用食管鱗

34、癌Eca109和EC9706細(xì)胞后在Ⅱ期(早期凋亡期)的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別從7.86％上升至38.03％和從6.98％上升至26.55％。結(jié)果表明,硝普鈉能激活能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　 4β-catenin siRNA干擾食管鱗癌細(xì)胞后對(duì)β-catenin信號(hào)通路的影響
　　 4.1β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染后β-catenin、c-myc和cyclin D1 mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化
　　 將β-ca

35、tenin siRNA分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞0 h、24 h、48 h,β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染48h后的β-catenin mRNA水平達(dá)到最低；β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染24 h后cyclin D1mRNA水平開(kāi)始逐漸下降,轉(zhuǎn)染48 h也達(dá)到最低。β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染前后c-myc基因的表達(dá)則無(wú)明顯影響。Western blots結(jié)果顯示β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染48 h后的β-catenin的蛋白水平

36、最低；β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染24 h后cyclin D1蛋白開(kāi)始逐漸下降,轉(zhuǎn)染48 h后蛋白水平最低。β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)c-myc蛋白的表達(dá)無(wú)影響。
　　 4.2β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染后對(duì)細(xì)胞周期的影響
　　 轉(zhuǎn)染β-catenin siRNA的Eca109細(xì)胞同未轉(zhuǎn)染組相比G0/C1期的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)從52.3％上升到66.5％且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),β-cateni

37、n siRNA轉(zhuǎn)染聯(lián)合硝普鈉作用的Eca109細(xì)胞G0/G1期的百分?jǐn)?shù)同轉(zhuǎn)染β-catenin siRNA的Eca109細(xì)胞相比百分?jǐn)?shù)從66.5％上升到68.2％且差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；同樣地,轉(zhuǎn)染β-catenin siRNA的EC9706細(xì)胞同未轉(zhuǎn)染組相比G0/G1期的百分?jǐn)?shù)從57.1％上升到73.1％且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),β-cateninsiRNA轉(zhuǎn)染聯(lián)合硝普鈉作用的EC9706細(xì)胞G0/G1期的

38、百分?jǐn)?shù)同轉(zhuǎn)染β-cateninsiRNA的Eca109細(xì)胞相比百分?jǐn)?shù)從73.1％上升到77.8％且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示β-catenin siRNA聯(lián)合硝普鈉可能會(huì)對(duì)食管鱗癌細(xì)胞株的細(xì)胞周期進(jìn)程具有協(xié)同抑制作用。
　　 4.3β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染后對(duì)細(xì)胞凋亡的影響
　　 β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染Eca109和EC9706細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染組相比在Ⅱ期的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別從1.40％提高至

39、16.88％和從0.71％提高至11.88％,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.Wnt2和β-catenin在從食管正常組織、癌旁組織到食管鱗癌組織的發(fā)展過(guò)程中陽(yáng)性表達(dá)率呈逐漸升高趨勢(shì),其中在食管鱗癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率最高。提示食管鱗癌中存在Wnt2/β-catenin信號(hào)通路的異常激活。
　　 2.β-catenin異常表達(dá)和c-myc陽(yáng)性表達(dá)與浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和五年生存率相關(guān)

40、(P<0.05),提示β-catenin和c-myc可作為判斷食管鱗癌患者預(yù)后的指標(biāo)。
　　 3.硝普鈉能明顯地下調(diào)β-catenin和c-myc的表達(dá)且誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡,提示硝普鈉誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用可能是通過(guò)β-catenin/c-myc信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　 4.β-catenin siRNA能特異性下調(diào)食管鱗癌細(xì)胞中β-catenin和cyclin D1的表達(dá)且能誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡,提示