重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pLEGFP-BDNF的構(gòu)建和在神經(jīng)干細(xì)胞中表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：阿爾茨海默病(AD)，也稱老年性癡呆，是腦神經(jīng)元退變性疾病，其主要癥狀是進(jìn)行性記憶力減退和認(rèn)知障礙。隨著人口老化，AD發(fā)病增多，發(fā)病機(jī)制未明，目前尚無有效的治療方法，給家庭、社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)。因此，亟需研究尋找有效治療措施。 近年來，神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)移植、轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞載體和損傷修復(fù)材料，利用神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行移植治療，或通過病毒載體將目的基因?qū)肷窠?jīng)干細(xì)胞，為神經(jīng)系統(tǒng)退行性變和神經(jīng)損傷的臨床治療帶來新

2、的曙光。NSCs能夠不斷分裂增殖、具有多分化潛能，可以分化成神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，在體內(nèi)可以根據(jù)不同腦區(qū)的微環(huán)境分化成該區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞。這種新的細(xì)胞具有以下優(yōu)點(diǎn)：1．NSCs在腦中能根據(jù)其周圍微環(huán)境的誘導(dǎo)而分裂，分化成相應(yīng)的細(xì)胞類型，其形態(tài)和功能與附近的宿主細(xì)胞非常類似，因而能部分補(bǔ)償損傷和死亡細(xì)胞的功能；2．中樞神經(jīng)系統(tǒng)具備特殊的結(jié)構(gòu)——血腦屏障，這使得淋巴細(xì)胞在正常情況下很難進(jìn)入，因此不同個(gè)體之間，甚至是不同物種之間的NSCs移植都幾

3、乎沒有排異反應(yīng)，大大拓寬了NSCs的來源；3．NSCs可以在體外根據(jù)不同的需要導(dǎo)入相應(yīng)的外源基因，成為一種廣譜的細(xì)胞載體。 神經(jīng)營養(yǎng)因子(NTFs)是由靶細(xì)胞分泌的一組特異性蛋白分子，有促進(jìn)和維護(hù)神經(jīng)元生長、存活、分化和執(zhí)行功能的作用。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)是最主要的神經(jīng)營養(yǎng)因子之一，對(duì)周圍神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)多種遞質(zhì)神經(jīng)元具有廣譜作用，具有很強(qiáng)的刺激和促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長、分化及促使損傷細(xì)胞修復(fù)的作用。文獻(xiàn)報(bào)道給予體外培

4、養(yǎng)的神經(jīng)前體細(xì)胞加入BDNF 主要促其向神經(jīng)元方向分化。但目前BDNF仍未能在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床治療中應(yīng)用，因?yàn)锽DNF是天然的蛋白分子，難以通過血腦屏障，如何把足量的BDNF傳送到中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的適當(dāng)部位仍存在困難，而且經(jīng)常性的腦內(nèi)注射給藥，有導(dǎo)致顱內(nèi)新的損害或感染的可能。因此，基因轉(zhuǎn)染是目前能提供長期療效的治療方法，基因修飾的細(xì)胞腦內(nèi)移植現(xiàn)已成為研究的重點(diǎn)。采用BDNF基因修飾NSCs，不僅可利用它對(duì)各種神經(jīng)元的營養(yǎng)作用，而且可利

5、用它能夠促進(jìn)NSCs主要向神經(jīng)元方向分化的功能，使NSCs移植腦內(nèi)后能更大限度地補(bǔ)償損傷和死亡的神經(jīng)元，達(dá)到緩解和改善AD癥狀的目的。 目前常用的轉(zhuǎn)基因載體包括一些病毒載體(腺病毒、腺相關(guān)病毒等)和陽性脂質(zhì)體，它們各有不同的特點(diǎn)，目前在轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中適于作為短時(shí)期表達(dá)研究。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體由于其結(jié)構(gòu)和生命周期的原因，并由于已經(jīng)除去了病毒復(fù)制所必須的包裝順序而不能復(fù)制，只能借助逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞，能穩(wěn)定地將外源基因插入和整合到宿豐細(xì)胞

6、基因組內(nèi)，并隨細(xì)胞分裂而傳代，提供了一個(gè)高效的、穩(wěn)定的、長期的目的基因轉(zhuǎn)移手段，適于作為基因轉(zhuǎn)染的載體。 本研究采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法從大鼠海馬組織總RNA擴(kuò)增BDNF基因，構(gòu)建含BDNF基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體，將重組體導(dǎo)入神經(jīng)干細(xì)胞，并進(jìn)行BDNF表達(dá)的檢測(cè)及其生物活性鑒定，為探討NSCs基因治療AD動(dòng)物模型奠定基礎(chǔ)。 方法： 1．RT-PCR技術(shù)獲取BDNF cDNA基因片段根據(jù)Ge

7、ne Bank上大鼠BDNF的cDNA功能全長序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物并導(dǎo)入Hind Ⅲ和BamH Ⅰ限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。 2．pLEGFP-BDNF重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定切膠回收陽性條帶，用DNA純化試劑盒純化，在T4 DNA連接酶作用下，將pMD 18-T simple vector與目的基因片段進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)菌中，藍(lán)白斑篩選，按試劑盒說明提取質(zhì)粒，酶切鑒定，測(cè)序得到pMDT-BDNF重組質(zhì)粒。用BamH

8、Ⅰ、Hind Ⅲ分別雙酶切pMDT-BDNF質(zhì)粒和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLEGFP-N1，電泳線性片段并予以切膠回收、純化。 3．BDNF基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞的構(gòu)建及表達(dá)復(fù)蘇逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞PT67，培養(yǎng)于含10％FBS的L-DMED培養(yǎng)基中，至細(xì)胞70％-80％匯片，脂質(zhì)體Lipofectamine 2000介導(dǎo)pLEGFP-BDNF重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PT67細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48h，用含400ug/ml G418的L-DMEM進(jìn)行篩選，1W后