在纖維蛋白凝塊上誘導(dǎo)臍間充質(zhì)干細胞向膀胱尿路上皮細胞分化的研究.pdf

1、目的：探討臍血來源間充質(zhì)干細胞在纖維蛋白凝塊上分化為膀胱尿路上皮細脆的可能性。
　　內(nèi)容：實驗組，將臍血間充質(zhì)干細胞接種于人工制備的臍血來源的纖維蛋白凝塊上與胎兒膀胱尿路上皮細胞共培養(yǎng)。對照組，臍血間充質(zhì)干細胞接種于人工制備的臍血來源的纖維蛋白凝膠上僅用DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。倒置相差顯鐒鏡觀察臍血間充質(zhì)干細胞、胎兒膀胱尿路上皮細胞的形態(tài)，透射電子顯微鏡下觀察鑒定尿路上皮，免疫組織化學(xué)染色觀察細胞廣譜角蛋白胞漿表達。
　

2、　方法：1.采用密度梯度離心從胎兒的臍帶血中分離提取間充質(zhì)干細胞，采用貼壁篩選培養(yǎng)法進行培養(yǎng)和純化UCB-MSCs。
　　2.取生長良好的第三代UCB-MSCs，通過流式細胞儀檢測細胞表面抗原標記(CD44，CD90CD34，CD45)進行細胞檢測。
　　3.利用膠原酶消化法分離膀胱尿路上皮細胞，用透射電鏡和免疫組織化學(xué)染色細胞廣譜角蛋白鑒定細胞。
　　4.采用加入氯化鈣溶液的方法用臍血的血漿，制備纖維蛋白凝塊。

3、>　　5.將一定密度的臍血間充質(zhì)干細胞接種于纖維蛋白凝塊表面，使其生長。
　　6.應(yīng)用共培養(yǎng)技術(shù)將接種有UCB-MSCs的纖維蛋白凝塊與膀胱尿路上皮細胞共培養(yǎng)，通過體外微環(huán)境誘導(dǎo)UCB-MSCs，收集誘導(dǎo)14天后的纖維蛋白凝塊上的UCB-MSCs進行透射電鏡和免疫組織化學(xué)染色細胞廣譜角蛋白鑒定細胞。
　　結(jié)果：1.采用密度梯度離心從胎兒的臍帶血中分離提取間充質(zhì)干細胞，經(jīng)過傳代培養(yǎng)得到純化，第三代細胞大部分呈長梭形，排列規(guī)則，

4、呈水草樣狀。流式細胞儀檢測細胞表面標志物CD44，CD90表達陽性，而造血干細胞和內(nèi)皮細胞的標記CD34，CD45表達陰性，這表明細胞為間充質(zhì)干細胞。
　　2.利用膠原酶消化法分離得到的膀胱尿路上皮細胞，可以進行傳代培養(yǎng)，通過免疫細胞化學(xué)染色細胞廣譜角蛋白陽性和透射電鏡兩種方法來鑒定，結(jié)果表明細胞為膀胱尿路上皮細胞。
　　3.應(yīng)用共培養(yǎng)技術(shù)將接種有UCB-MSCs的纖維蛋白凝塊與膀胱尿路上皮細胞共培養(yǎng)：纖維蛋白凝塊上臍血間充

5、質(zhì)干細胞逐漸伸展呈多角形，細胞扁平變大，透射電子顯微鏡下具有膀胱尿路上皮細胞的超微結(jié)構(gòu)，抗廣譜角蛋白(AE1/AE3)免疫組織化學(xué)染色陽性。
　　結(jié)論：1.體外成功從胎兒臍帶血中分離培養(yǎng)得到純度較高的MSCs，且該細胞具有干細胞的自我更新和多向分化潛能的特點。
　　2.體外成功的從引產(chǎn)胎兒膀胱中分離、培養(yǎng)獲得完全純化的膀胱尿路上皮細胞，為共培養(yǎng)提供了細胞微環(huán)境。
　　3.體外利用共培養(yǎng)的方法將纖維蛋白凝塊上誘導(dǎo)臍血問充