體外誘導大鼠骨髓間充質干細胞向子宮韌帶成纖維細胞分化的研究.pdf

1、研究背景:人體盆底組織主要起承載人體盆腔各臟器的作用,女性盆底組織主要包括封閉骨盆出口的多層肌肉、筋膜及子宮韌帶。這些組織因各種原因(如:妊娠、分娩、便秘、長期咳嗽等)發(fā)生損傷或撕裂而使其支持功能減弱時,即發(fā)生子宮及相鄰的直腸、膀胱、陰道壁發(fā)生移位及功能障礙,臨床上稱之為盆底功能障礙疾病(pelvic floor dysunction, PFD),主要指壓力性尿失禁(stress urinary incontinence, SUI)和盆

2、腔臟器脫垂(pelvic orgen prolapse, POP)。目前治療方法主要包括手術治療和保守性的藥物治療及盆底肌肉鍛煉等康復治療,但這些治療均有其不足之處。特別是韌帶組織,損傷后其修復過程形成瘢痕組織,不是真正意義上的再生,同時對盆底起最主要支持力量的子宮宮骶韌帶-主韌帶復合體的結構功能又與PFD的發(fā)生、發(fā)展密切相關。因此,如何使損傷后的子宮韌帶恢復其正常的結構和功能,是真正治療該疾病急需解決的問題。組織工程學的誕生,為子宮韌

3、帶的修復提供了新的手段。最近的研究表明:在修復過程中,受損韌帶局部出現(xiàn)來源于骨髓間充質的干細胞,其性狀與周圍的韌帶成纖維細胞非常相似。在受損膝腱、髕韌帶中注射入含骨髓間充質干細胞或成纖維細胞的纖連蛋白基質可影響其組織學形態(tài)、超微結構和必需的細胞外基質蛋白mRNA的表達,使受損膝腱、韌帶更容易恢復。另外發(fā)現(xiàn),骨髓間充質干細胞與肌腱或韌帶成纖維細胞共培養(yǎng)后可提高兔肌腱、韌帶相關基因的表達。骨髓間充質干細胞(bone marrow mesen

4、chymal stem cells, BMSCs)是一種具有自我復制和多向分化潛能的原始細胞,在體內、外均可定向誘導分化為具有各種表型的子代細胞。
　　本研究旨在研究體外正常細胞及機械牽張損傷細胞在共培養(yǎng)體系中定向誘導BMSCs分化為子宮韌帶成纖維細胞的影響。實驗中用機械牽張刺激損傷體外培養(yǎng)的大鼠子宮韌帶成纖維細胞,造成PFD的細胞損傷模型,將BMSCs與正常子宮韌帶成纖維細胞和機械牽張損傷的子宮韌帶成纖維細胞在體外間接共培養(yǎng)(非

5、接觸式)。同時,檢測共培養(yǎng)誘導后BMSCs彈性蛋白、賴氨酰氧化酶(lysyloxidase,LOX)、Fibulin-5的表達情況,以進一步認識BMSCs的分化潛能及生物學特性。
　　本文研究了在體外通過非接觸式共培養(yǎng)誘導BMSCs向子宮韌帶成纖維細胞的分化,為從組織工程學角度以根源上治療PFD疾病提供可能的研究思路及新的治療手段。
　　研究方法:1.大鼠BMSCs的體外分離培養(yǎng):采用密度梯度離心法結合傳代貼壁篩選法分離純化

6、獲得大鼠BMSCs;通過形態(tài)學觀察、細胞生長曲線繪制、細胞表面特異抗原及細胞周期的流式細胞學檢測,對體外培養(yǎng)獲得的BMSCs進行初步鑒定;采用體外誘導大鼠BMSCs向成骨細胞和成脂細胞的分化,對獲得的BMSCs的生物學功能進行鑒定。
　　2.大鼠子宮韌帶成纖維細胞的體外分離培養(yǎng)及鑒定:采用大鼠子宮韌帶組織塊酶消化法,進行子宮韌帶成纖維細胞的原代培養(yǎng),通過形態(tài)學觀察、細胞生長曲線的繪制及免疫組化測定其膠原Ⅰ、Ⅲ蛋白的表達對獲得的子宮

7、韌帶成纖維細胞進行鑒定。
　　3.對大鼠子宮韌帶成纖維細胞進行體外機械牽張,建立機械牽張損傷模型:根據(jù)韌帶成纖維細胞的生物學特性,在細胞牽張儀上采用負載10％應力,1赫茲的機械牽張刺激大鼠子宮韌帶成纖維細胞3h、6h、12h、24h、36h不同時間段后,通過透射電鏡、鬼筆環(huán)肽染色觀察不同時間牽張損傷后成纖維細胞的超微結構和細胞骨架的變化情況;采用實時定量RT-PCR技術測定不同時間牽張損傷后成纖維細胞Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的合成能力;

8、用臺盼藍染色觀察細胞的凋亡情況。
　　4.大鼠BMSCs與大鼠子宮韌帶成纖維細胞共培養(yǎng)體系的建立:將大鼠BMSCs與正常及不同牽張時間后的大鼠子宮韌帶成纖維細胞間接共培養(yǎng)3、6、12天,采用實時定量RT-PCR檢測BMSCs中彈性蛋白、LOX及Fibulin-5 mRNA的表達情況;采用免疫蛋白印記法(western-blot)檢測BMSCs中彈性蛋白、LOX及Fibulin-5蛋白的合成情況。應用SPSS16.0軟件包進行數(shù)據(jù)處

9、理。所有數(shù)據(jù)結果均采用平均數(shù)±標準差(χ±s)表示。用one-way ANOVA檢驗樣本與對照組的組間差異,以a=0.05作為檢驗水準。
　　實驗結果:1.體外獲得的大鼠骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs),其細胞形態(tài)均一,呈梭形、扁平形,增殖至細胞融合時,細胞為典型的長梭形,呈集落樣或放射狀排列,有一定的極性;檢測第四代大鼠BMSCs表面特異抗原分子,99.0％以

10、上細胞CD90表達陽性,98.8％以上的細胞CD44表達陽性,CD34、CD45均表達陰性,分別為1.8％和3.7％;細胞周期結果顯示:第4代BMSCs處于G0/G1期的細胞約為80％以上,表明大多數(shù)細胞處于靜止期;細胞生長曲線典型,且所得細胞可被誘導為成骨和成脂細胞,符合間充質干細胞的特征。
　　2.體外成功獲得子宮韌帶成纖維細胞,細胞貼壁生長,形態(tài)呈梭形,與典型的成纖維細胞形態(tài)相似;細胞生長曲線典型,免疫組化測定其膠原Ⅰ、Ⅲ型

11、蛋白的表達均符合韌帶成纖維細胞特征。
　　3.本實驗以1Hz的強度,負載10％牽張刺激細胞,用熒光物質(鬼筆環(huán)肽和DAPI)分別對所得細胞內F-actin和細胞核進行特異性標記,結果提示:F-actin在機械牽張下發(fā)生了解聚和重排。力學牽張短時間內子宮韌帶成纖維細胞未出現(xiàn)明顯變化,長時間刺激后細胞變狹長,排列無序,超微結構出現(xiàn)損傷,甚至出現(xiàn)凋亡。
　　4.對大鼠子宮韌帶成纖維細胞中膠原Ⅰ和膠原ⅢmRNA的表達量進行檢測,結果

12、表明:牽張刺激3h、6h、12h后,膠原mRNA的表達量隨牽張時間逐漸增多,牽張刺激24h、36h后,膠原mRNA的表達量隨牽張時間逐漸降低,其中牽張刺激12h大鼠子宮韌帶成纖維細胞中膠原mRNA的表達量最多。同時,與對照組(未受牽張刺激的正常成纖維細胞)相比,牽張刺激3h、6h、12h、24h,膠原mRNA的表達量均增加;而牽張刺激36h,膠原mRNA的表達量較對照組降低。
　　5.通過實時定量RT-PCR和免疫蛋白印記法(We

13、ston-Blot)對共培養(yǎng)3天、6天、12天的對照組、間接共培養(yǎng)組、牽張間接共培養(yǎng)組誘導后BMSCs合成分泌彈性蛋白、LOX、Fibulin-5mRNA及蛋白進行檢測,結果顯示:
　　(1)共培養(yǎng)3天組間mRNA相對量分別為:牽張間接共培養(yǎng)組2.01±0.12,1.92±0.07,2.02±0.0,間接共培養(yǎng)組1.41±0.06,1.26±0.06,1.16±0.11,對照組1.00±0.03,1.00±0.04,1.00±0.

14、06;蛋白相對量分別為:牽張間接共培養(yǎng)組0.30±0.11,0.45±0.07,0.29±0.14,間接共培養(yǎng)組為0.21±0.15,0.39±0.08,0.20±0.15,對照組為0.17±0.07,0.35±0.10,0.14±0.07;表達均無差異(P＞0.05)。
　　(2)共培養(yǎng)6天組間mRNA目對量分別為:牽張間接共培養(yǎng)組3.81±0.13,2.11±0.07,3.90±0.11,間接共培養(yǎng)組2.69±0.08,1.6

15、2±0.11,2.59±0.09,對照組1.29±0.05,1.11±0.041.21±0.07;蛋白相對量分別為:牽張間接共培養(yǎng)組0.45±0.09,0.61±0.14,0.37±0.07,間接共培養(yǎng)組0.39±0.06,0.45±0.14,0.23±0.04,對照組0.19±0.12,0.36±0.06,0.15±0.04;三組間有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。進一步做兩兩比較,組間均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05),并呈線性增強。

16、>　　(3)共培養(yǎng)12天組間mRNA相對量分別為:牽張間接共培養(yǎng)組4.54±0.16,2.50±0.09,4.21±0.15,間接共培養(yǎng)組2.93±0.14,1.71±0.09,2.89±0.08,對照組1.50±0.04,1.19±0.18,1.60±0.07;蛋白相對量分別為:牽張間接共培養(yǎng)組0.51±0.14,0.63±0.18,0.40±0.17,間接共培養(yǎng)組為0.42±0.14,0.49±0.11,0.24±0.06,對照組0

17、.20±0.13,0.38±0.15,0.18±0.06;三組間有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。進一步做兩兩比較,組間均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05),并呈線性增強。
　　結論:1.負載10％形變,1Hz單項水平牽張刺激12小時損傷的細胞,可以作為較為合理的子宮韌帶成纖維細胞牽張的時間和頻率及強度。
　　2. BMSCs與大鼠正常子宮韌帶成纖維細胞和牽張損傷后子宮韌帶成纖維細胞間接共培養(yǎng),均可誘導BMSCs向子宮韌帶成纖維細胞分