體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向子宮韌帶成纖維細(xì)胞分化的研究.pdf

1、研究背景:人體盆底組織主要起承載人體盆腔各臟器的作用,女性盆底組織主要包括封閉骨盆出口的多層肌肉、筋膜及子宮韌帶。這些組織因各種原因(如:妊娠、分娩、便秘、長期咳嗽等)發(fā)生損傷或撕裂而使其支持功能減弱時,即發(fā)生子宮及相鄰的直腸、膀胱、陰道壁發(fā)生移位及功能障礙,臨床上稱之為盆底功能障礙疾病(pelvic floor dysunction, PFD),主要指壓力性尿失禁(stress urinary incontinence, SUI)和盆

2、腔臟器脫垂(pelvic orgen prolapse, POP)。目前治療方法主要包括手術(shù)治療和保守性的藥物治療及盆底肌肉鍛煉等康復(fù)治療,但這些治療均有其不足之處。特別是韌帶組織,損傷后其修復(fù)過程形成瘢痕組織,不是真正意義上的再生,同時對盆底起最主要支持力量的子宮宮骶韌帶-主韌帶復(fù)合體的結(jié)構(gòu)功能又與PFD的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。因此,如何使損傷后的子宮韌帶恢復(fù)其正常的結(jié)構(gòu)和功能,是真正治療該疾病急需解決的問題。組織工程學(xué)的誕生,為子宮韌

3、帶的修復(fù)提供了新的手段。最近的研究表明:在修復(fù)過程中,受損韌帶局部出現(xiàn)來源于骨髓間充質(zhì)的干細(xì)胞,其性狀與周圍的韌帶成纖維細(xì)胞非常相似。在受損膝腱、髕韌帶中注射入含骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞或成纖維細(xì)胞的纖連蛋白基質(zhì)可影響其組織學(xué)形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)和必需的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白mRNA的表達,使受損膝腱、韌帶更容易恢復(fù)。另外發(fā)現(xiàn),骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與肌腱或韌帶成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)后可提高兔肌腱、韌帶相關(guān)基因的表達。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesen

4、chymal stem cells, BMSCs)是一種具有自我復(fù)制和多向分化潛能的原始細(xì)胞,在體內(nèi)、外均可定向誘導(dǎo)分化為具有各種表型的子代細(xì)胞。
　　本研究旨在研究體外正常細(xì)胞及機械牽張損傷細(xì)胞在共培養(yǎng)體系中定向誘導(dǎo)BMSCs分化為子宮韌帶成纖維細(xì)胞的影響。實驗中用機械牽張刺激損傷體外培養(yǎng)的大鼠子宮韌帶成纖維細(xì)胞,造成PFD的細(xì)胞損傷模型,將BMSCs與正常子宮韌帶成纖維細(xì)胞和機械牽張損傷的子宮韌帶成纖維細(xì)胞在體外間接共培養(yǎng)(非

5、接觸式)。同時,檢測共培養(yǎng)誘導(dǎo)后BMSCs彈性蛋白、賴氨酰氧化酶(lysyloxidase,LOX)、Fibulin-5的表達情況,以進一步認(rèn)識BMSCs的分化潛能及生物學(xué)特性。
　　本文研究了在體外通過非接觸式共培養(yǎng)誘導(dǎo)BMSCs向子宮韌帶成纖維細(xì)胞的分化,為從組織工程學(xué)角度以根源上治療PFD疾病提供可能的研究思路及新的治療手段。
　　研究方法:1.大鼠BMSCs的體外分離培養(yǎng):采用密度梯度離心法結(jié)合傳代貼壁篩選法分離純化

6、獲得大鼠BMSCs;通過形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞生長曲線繪制、細(xì)胞表面特異抗原及細(xì)胞周期的流式細(xì)胞學(xué)檢測,對體外培養(yǎng)獲得的BMSCs進行初步鑒定;采用體外誘導(dǎo)大鼠BMSCs向成骨細(xì)胞和成脂細(xì)胞的分化,對獲得的BMSCs的生物學(xué)功能進行鑒定。
　　2.大鼠子宮韌帶成纖維細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)及鑒定:采用大鼠子宮韌帶組織塊酶消化法,進行子宮韌帶成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng),通過形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞生長曲線的繪制及免疫組化測定其膠原Ⅰ、Ⅲ蛋白的表達對獲得的子宮

7、韌帶成纖維細(xì)胞進行鑒定。
　　3.對大鼠子宮韌帶成纖維細(xì)胞進行體外機械牽張,建立機械牽張損傷模型:根據(jù)韌帶成纖維細(xì)胞的生物學(xué)特性,在細(xì)胞牽張儀上采用負(fù)載10％應(yīng)力,1赫茲的機械牽張刺激大鼠子宮韌帶成纖維細(xì)胞3h、6h、12h、24h、36h不同時間段后,通過透射電鏡、鬼筆環(huán)肽染色觀察不同時間牽張損傷后成纖維細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)和細(xì)胞骨架的變化情況;采用實時定量RT-PCR技術(shù)測定不同時間牽張損傷后成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的合成能力;

8、用臺盼藍(lán)染色觀察細(xì)胞的凋亡情況。
　　4.大鼠BMSCs與大鼠子宮韌帶成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)體系的建立:將大鼠BMSCs與正常及不同牽張時間后的大鼠子宮韌帶成纖維細(xì)胞間接共培養(yǎng)3、6、12天,采用實時定量RT-PCR檢測BMSCs中彈性蛋白、LOX及Fibulin-5 mRNA的表達情況;采用免疫蛋白印記法(western-blot)檢測BMSCs中彈性蛋白、LOX及Fibulin-5蛋白的合成情況。應(yīng)用SPSS16.0軟件包進行數(shù)據(jù)處

9、理。所有數(shù)據(jù)結(jié)果均采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(χ±s)表示。用one-way ANOVA檢驗樣本與對照組的組間差異,以a=0.05作為檢驗水準(zhǔn)。
　　實驗結(jié)果:1.體外獲得的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs),其細(xì)胞形態(tài)均一,呈梭形、扁平形,增殖至細(xì)胞融合時,細(xì)胞為典型的長梭形,呈集落樣或放射狀排列,有一定的極性;檢測第四代大鼠BMSCs表面特異抗原分子,99.0％以

10、上細(xì)胞CD90表達陽性,98.8％以上的細(xì)胞CD44表達陽性,CD34、CD45均表達陰性,分別為1.8％和3.7％;細(xì)胞周期結(jié)果顯示:第4代BMSCs處于G0/G1期的細(xì)胞約為80％以上,表明大多數(shù)細(xì)胞處于靜止期;細(xì)胞生長曲線典型,且所得細(xì)胞可被誘導(dǎo)為成骨和成脂細(xì)胞,符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特征。
　　2.體外成功獲得子宮韌帶成纖維細(xì)胞,細(xì)胞貼壁生長,形態(tài)呈梭形,與典型的成纖維細(xì)胞形態(tài)相似;細(xì)胞生長曲線典型,免疫組化測定其膠原Ⅰ、Ⅲ型

11、蛋白的表達均符合韌帶成纖維細(xì)胞特征。
　　3.本實驗以1Hz的強度,負(fù)載10％牽張刺激細(xì)胞,用熒光物質(zhì)(鬼筆環(huán)肽和DAPI)分別對所得細(xì)胞內(nèi)F-actin和細(xì)胞核進行特異性標(biāo)記,結(jié)果提示:F-actin在機械牽張下發(fā)生了解聚和重排。力學(xué)牽張短時間內(nèi)子宮韌帶成纖維細(xì)胞未出現(xiàn)明顯變化,長時間刺激后細(xì)胞變狹長,排列無序,超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)損傷,甚至出現(xiàn)凋亡。
　　4.對大鼠子宮韌帶成纖維細(xì)胞中膠原Ⅰ和膠原ⅢmRNA的表達量進行檢測,結(jié)果

12、表明:牽張刺激3h、6h、12h后,膠原mRNA的表達量隨牽張時間逐漸增多,牽張刺激24h、36h后,膠原mRNA的表達量隨牽張時間逐漸降低,其中牽張刺激12h大鼠子宮韌帶成纖維細(xì)胞中膠原mRNA的表達量最多。同時,與對照組(未受牽張刺激的正常成纖維細(xì)胞)相比,牽張刺激3h、6h、12h、24h,膠原mRNA的表達量均增加;而牽張刺激36h,膠原mRNA的表達量較對照組降低。
　　5.通過實時定量RT-PCR和免疫蛋白印記法(We

13、ston-Blot)對共培養(yǎng)3天、6天、12天的對照組、間接共培養(yǎng)組、牽張間接共培養(yǎng)組誘導(dǎo)后BMSCs合成分泌彈性蛋白、LOX、Fibulin-5mRNA及蛋白進行檢測,結(jié)果顯示:
　　(1)共培養(yǎng)3天組間mRNA相對量分別為:牽張間接共培養(yǎng)組2.01±0.12,1.92±0.07,2.02±0.0,間接共培養(yǎng)組1.41±0.06,1.26±0.06,1.16±0.11,對照組1.00±0.03,1.00±0.04,1.00±0.

14、06;蛋白相對量分別為:牽張間接共培養(yǎng)組0.30±0.11,0.45±0.07,0.29±0.14,間接共培養(yǎng)組為0.21±0.15,0.39±0.08,0.20±0.15,對照組為0.17±0.07,0.35±0.10,0.14±0.07;表達均無差異(P＞0.05)。
　　(2)共培養(yǎng)6天組間mRNA目對量分別為:牽張間接共培養(yǎng)組3.81±0.13,2.11±0.07,3.90±0.11,間接共培養(yǎng)組2.69±0.08,1.6

15、2±0.11,2.59±0.09,對照組1.29±0.05,1.11±0.041.21±0.07;蛋白相對量分別為:牽張間接共培養(yǎng)組0.45±0.09,0.61±0.14,0.37±0.07,間接共培養(yǎng)組0.39±0.06,0.45±0.14,0.23±0.04,對照組0.19±0.12,0.36±0.06,0.15±0.04;三組間有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。進一步做兩兩比較,組間均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05),并呈線性增強。

16、>　　(3)共培養(yǎng)12天組間mRNA相對量分別為:牽張間接共培養(yǎng)組4.54±0.16,2.50±0.09,4.21±0.15,間接共培養(yǎng)組2.93±0.14,1.71±0.09,2.89±0.08,對照組1.50±0.04,1.19±0.18,1.60±0.07;蛋白相對量分別為:牽張間接共培養(yǎng)組0.51±0.14,0.63±0.18,0.40±0.17,間接共培養(yǎng)組為0.42±0.14,0.49±0.11,0.24±0.06,對照組0

17、.20±0.13,0.38±0.15,0.18±0.06;三組間有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。進一步做兩兩比較,組間均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05),并呈線性增強。
　　結(jié)論:1.負(fù)載10％形變,1Hz單項水平牽張刺激12小時損傷的細(xì)胞,可以作為較為合理的子宮韌帶成纖維細(xì)胞牽張的時間和頻率及強度。
　　2. BMSCs與大鼠正常子宮韌帶成纖維細(xì)胞和牽張損傷后子宮韌帶成纖維細(xì)胞間接共培養(yǎng),均可誘導(dǎo)BMSCs向子宮韌帶成纖維細(xì)胞分