共培養(yǎng)誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向leydig細(xì)胞分化的研究.pdf

1、研究背景
　　 隨著環(huán)境污染、人口老齡化的日益加重，雄激素缺乏性疾病的發(fā)病率具有逐年上升的趨勢，雄激素的缺乏不但嚴(yán)重影響患者身體健康如男性第二性征異常、造成生理功能紊亂，且嚴(yán)重影響男性的心理健康，容易造成社會問題[1、2]。
　　 針對這類疾病，傳統(tǒng)上的治療主要靠外源性的雄性激素補(bǔ)充或替代，但由于外源性雄激素補(bǔ)充無法接受垂體-性腺軸的生理調(diào)節(jié)，易造成體內(nèi)激素失調(diào)失調(diào)，且抑制體內(nèi)的正常雄性激素的分泌，長期使用常會引起高血壓

2、、紅細(xì)胞增多、骨密度異常等一系列嚴(yán)重并發(fā)癥[2]。與之相比，Leydig細(xì)胞移植，可接受下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)節(jié)，符合人的生理規(guī)律，具有明顯優(yōu)勢，是治療雄激素缺乏性疾病的可靠、理想的治療途徑[5]。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，采用組織工程技術(shù)以Leydig細(xì)胞作為種子細(xì)胞，重建具有正常生理功能和形態(tài)的組織，則有望在形態(tài)、功能兩個方面解決睪丸缺失/雄激素缺乏性疾病，為該類疾病的治療提供更符合生理的治療途徑[4]。
　　 雖然Leyd

3、ig細(xì)胞治療具有明顯的優(yōu)勢，但細(xì)胞來源不足和免疫排斥問題是制約該技術(shù)發(fā)展的主要瓶頸。Leydig細(xì)胞僅存于睪丸，數(shù)量有限（僅占睪丸細(xì)胞總量的2-5％），普遍依靠同種異體供應(yīng)，存在免疫排斥問題，臨床廣泛應(yīng)用受到極大限制[5]。
　　 來源于自體骨髓組織或脂肪組織的間充質(zhì)干細(xì)胞，取材方便，通過體外分離、培養(yǎng)及富集，可獲得大量的細(xì)胞，如果能將其誘導(dǎo)成leydig細(xì)胞，則可以同時解決leydig細(xì)胞移植的來源及免疫排斥兩個問題。普遍認(rèn)為

4、，性腺及腎上腺等類固醇合成器官從來源于中段中胚層的腎上腺生殖器原基發(fā)育而來[6]，而Leydig細(xì)胞來源于胚胎發(fā)育期的中腎胚的間質(zhì)細(xì)胞，并認(rèn)為位于管周的成纖維樣細(xì)胞為leydig干細(xì)胞或前體細(xì)胞，leydig細(xì)胞由這些細(xì)胞分化而來[7]。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymAlStem Cells，MSCs）與leydig干細(xì)胞都來源于中胚層，因而具有向Leydig細(xì)胞轉(zhuǎn)化的理論可能[8]。普遍認(rèn)為類固醇因子-1（steroidogenic

5、 factor 1， SF-1）是睪丸及腎上腺發(fā)育及類固醇激素合成的關(guān)鍵的核內(nèi)受體，在它的調(diào)控下，類固醇合成酶的各個基因得以表達(dá)[6]。Tomoko Tanaka在2006年用骨髓基質(zhì)細(xì)胞注入發(fā)育期的大鼠睪丸內(nèi)，這些細(xì)胞表現(xiàn)出與leydig細(xì)胞相似的特性；同時將攜帶綠色熒光蛋白的P450scc用腺病毒攜帶AD/4Bp基因后轉(zhuǎn)染體外分離小鼠BMSCs，并在加入cAMP培養(yǎng)液中培養(yǎng)2周后，這些細(xì)胞表現(xiàn)出leydig細(xì)胞的特性，并能分泌睪酮[

6、8]。Gondo等在2008年用這種方法處理BMSCs及脂肪干細(xì)胞（adipose-derived mesenchymAlstem cells， AMSCs）后，發(fā)現(xiàn)BMSCs向產(chǎn)生睪酮的leydig細(xì)胞方向分化，而AMSCs則傾向于產(chǎn)生糖皮質(zhì)類激素的腎上腺細(xì)胞分化[6]。Takashi2009年將肝受體同系物-1（liver receptor homolog-1，LRH）以質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人的BMSCs及cAMP處理后，這些細(xì)胞表達(dá)腎上腺及睪

7、酮合成的基因[9]。該類實驗表明BMSCs在異位表達(dá)的SF-1的刺激下可以向leydig細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)錄并表達(dá)睪酮合成過程中所需的各種酶，并具有睪酮分泌功能。該類實驗主要用于研究性腺器官的發(fā)育，由于腺病毒轉(zhuǎn)染的潛在安全問題，誘導(dǎo)后的細(xì)胞在臨床治療中的意義不大，同時說明在誘導(dǎo)分化為leydig細(xì)胞上BMSCs比ADSCs更適合。
　　 另外的研究主要是利用leydig細(xì)胞在體內(nèi)生長的微環(huán)境在也可將BMSCs誘導(dǎo)向leydig細(xì)胞

8、方向分化。Takashi Yazawa及Tomoko Tanaka等將大鼠BMSCs注射入3周齡發(fā)育期大鼠睪丸，結(jié)果顯示注射的部分BMSCs能向Leydig細(xì)胞分化，并表達(dá)leydig細(xì)胞的各種細(xì)胞標(biāo)志物[8、10]。YanHe Lue等進(jìn)一步探討了BMSCs注射入睪丸的曲精小管及睪丸間質(zhì)的分化結(jié)局，綠色熒光蛋白標(biāo)記的BMSCs分別注射入正常leydig細(xì)胞的大鼠及c-kit基因沉默的W/Wv大鼠（睪丸發(fā)育缺陷，無法形成精原細(xì)胞）睪丸內(nèi)

9、，10-12周后注射入正常大鼠的睪丸內(nèi)BMSCs根據(jù)鄰近細(xì)胞的情況，依次分化為與鄰近細(xì)胞相識的Leydig細(xì)胞、Sertoli細(xì)胞、生殖細(xì)胞系細(xì)胞等體細(xì)胞成分，而注射入睪丸發(fā)育畸形鼠體內(nèi)的BMSCs未發(fā)生分化。雖該然不能完全排除細(xì)胞融合的可能，但是可以說明睪丸各種細(xì)胞生長的微環(huán)境對移植BMSCs的定向分化具有誘導(dǎo)作用[11]。
　　 上述研究成果顯示BMSCs誘導(dǎo)分化成為Leydig細(xì)胞具有可行性，但距臨床應(yīng)用仍有差距?；蜣D(zhuǎn)染

10、技術(shù)雖然有望在體外大量的誘導(dǎo)BMSCs分化為雄激素分泌細(xì)胞，但該方法必須克服腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)帶來的生物安全性問題，目前尚屬世界性難題。BMSCs睪丸內(nèi)注射屬實驗性研究，要求受體動物在發(fā)育期，對于Leydig細(xì)胞功能不足或不存在睪丸的受體意義不大，且分化的效率不高，目前通過該途徑很難獲得大量的自體BMSCs分化的Leydig細(xì)胞。然而，以上研究成果提示，雖然目前對睪丸分化微環(huán)境促進(jìn)BMSCs定向分化的始動因素并不明確，但通過體外模擬Leyd

11、ig細(xì)胞生長的微環(huán)境，在體外實現(xiàn)BMSCs向Leydig細(xì)胞大量的定向分化具備理論可能性。
　　 綜上所述，針對Leydig細(xì)胞治療及雄激素分泌組織構(gòu)建研究中關(guān)鍵的種子細(xì)胞來源問題，結(jié)合本課題組前期實驗中，通過差速貼壁法可以大量獲得較純的leydig細(xì)胞的基礎(chǔ)上，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與Leydig細(xì)胞共培養(yǎng)，利用leydig細(xì)胞生長的微環(huán)境及分泌的可溶性因子誘導(dǎo)BMSCs向Leydig細(xì)胞分化，以解決種子細(xì)胞來源不足的難題。該項研

12、究可為臨床雄性激素缺乏癥提供一條安全有效的途徑，同時對于進(jìn)一步研究胚胎發(fā)育過程中l(wèi)eydig干細(xì)胞具體分化過程中的各種細(xì)胞因子的作用及調(diào)控機(jī)制具有借鑒意義。研究目的
　　 本研究從骨髓基質(zhì)干細(xì)胞開始，通過Ficoll液分離、貼壁、增殖并傳代，富集足夠的BMSCs，并經(jīng)過誘導(dǎo)分化成骨、成脂肪鑒定BMSC的多向分化能力；通過差速貼壁法獲得的大鼠睪丸leydig細(xì)胞的免疫組化分析，證實差速貼壁法可以獲得較純的大鼠睪丸leydig細(xì)胞；

13、探索共培養(yǎng)體系對BMSC向leydig細(xì)胞誘導(dǎo)的可能性，并對誘導(dǎo)后的BMSC進(jìn)行l(wèi)eydig細(xì)胞的各項特異性指標(biāo)進(jìn)行免疫組化、RT-PCR的測定，檢驗誘導(dǎo)的BMSC作為雄激素分泌組織種子細(xì)胞的可行性，為解決組織工程化雄激素分泌組織研究中種子細(xì)胞來源不足的問題提供有效手段。
　　 研究方法
　　 一、 密度梯度離心法獲得骨髓基質(zhì)干細(xì)胞及鑒定：3周齡大鼠的股骨、脛骨，10ml注射器沖洗，1.083g/ml的ficoll去除血

14、細(xì)胞，2天后半量換液，4天后首次全部換液，獲取的貼壁細(xì)胞，并傳代培養(yǎng)。取第三代BMSC進(jìn)行成骨、成脂肪分化誘導(dǎo)。同時觀察細(xì)胞形態(tài)，克隆樣集落形成，并檢測細(xì)胞增殖情況。
　　 二、
　　 差速貼壁法分離純化3周鼠齡大鼠Leydig細(xì)胞：取3周齡雄性Wister大鼠雙側(cè)睪丸，無菌下去除白膜及較大的血管，用膠原酶震蕩消化和400目（Ф33μm）不銹鋼濾網(wǎng)過濾，離心后貼壁培養(yǎng)2小時，棄上清并漂洗3次，加入3％FBS的DMEM/F

15、12培養(yǎng)液培養(yǎng)。
　　 三、
　　 共培養(yǎng)體系對BMSC誘導(dǎo)分化作用：3周齡大鼠睪丸leydig分離后以transwell培養(yǎng)皿雙層間接共培養(yǎng)體系進(jìn)行培養(yǎng)，隔1-2天換液，2周、4周后對誘導(dǎo)的細(xì)胞 3β-HSD、LHR免疫化學(xué)染色、免疫熒光染色，PCR檢測stAR、3β-HSD及LHR的表達(dá)情況及睪酮分泌水平的測定。
　　 研究結(jié)論
　　 本研究證實差速貼壁法能夠有效獲得大鼠睪丸Leydig系細(xì)胞的各級細(xì)