蕪菁花青素合成關鍵基因F3H啟動子區(qū)序列及藍光受體CRY1基因的克隆與初步功能分析.pdf

1、依賴于藍光的花青素合成現(xiàn)象是植物中普遍存在的一種現(xiàn)象，近期研究表明這種現(xiàn)象是由植物藍光受體—隱花色素（Cryptochrome，CRY）所介導的。本研究對克隆花青素合成依光型蕪菁品種“津田”蕪菁中的花青素合成關鍵基因F3H(flavanone3-hydroxylase)的啟動子區(qū)序列以及藍光受體CRY1基因進行了克隆和功能分析，為揭示植物隱花色素對花青素合成的調節(jié)機制開展了必要的前期工作。1F3H啟動子區(qū)序列的克隆、分析與瞬時表達。

2、r>　　根據(jù)已經公布的Brassica rapa subsp.pekinensis中含有F3H基因的KBrS001M03克隆序列，采用常規(guī)PCR的方法，克隆得到“津田”蕪菁F3H基因啟動子區(qū)序列。在線比對和生物信息學分析表明此序列是位于“津田”蕪菁F3H基因上游的啟動子區(qū)序列，具有啟動子特征。利用plantcare工具分析統(tǒng)計此序列中的各個功能元件，發(fā)現(xiàn)其中除具有一般真核生物啟動子結構所普遍具有的保守CAAT box和TATA box等

3、序列外，還有許多其他的保守序列。
　　采用研究啟動子的pKGWFS7載體，利用Gateway技術將此序列替換到Gus基因的上游，驅動Gus基因在“津田”蕪菁無菌苗的離體胚軸和子葉中瞬時表達。檢測結果顯示，胚軸和子葉中均有Gus基因表達。而且無論是在光下還是在黑暗中，克隆到的F3H啟動子區(qū)序列均可驅動Gus基因正常表達?？梢娝寺〉男蛄芯哂袉幼庸δ?。
　　2蕪菁CRY1基因的克隆與功能初步分析
　　1) CRY1基因的

4、克隆及其功能分析
　　采用RT-PCR的方法克隆蕪菁的CRY1基因，對克隆得到序列進行和系統(tǒng)進化樹分析，初步確定其為CRY1基因。研究了此基因在不同波長光下的表達情況，結果表明蕪菁CRY1基因的表達量基本一致，為組成型表達。這說明CRY1與其他因子發(fā)生作用來傳遞光信號影響花青素的合成。利用酵母雙雜交系統(tǒng)研究蕪菁CRY1與COP1的相互作用的結果表明兩者之間具有相互作用，表明其具有與擬南芥中藍光受體傳遞光信號的類似機制。
　　

5、2) CRY1-dsRNAi表達載體的構建與遺傳轉化
　　為更深入的研究蕪菁CRY1的生理功能，采用Gateway克隆系統(tǒng)，根據(jù)克隆到的“津田”蕪菁CRY1基因序列設計RNA干涉引物，成功構建了蕪菁CRY1雙鏈RNA干擾表達載體:CRY1-dsRNAi。
　　采用農桿菌介導的方法轉化蕪菁，對影響蕪菁離體再生和農桿菌介導的遺傳轉化的各個因素進行了研究。通過對外植體類型、激素種類、AgNO3濃度、無菌苗苗齡、預培養(yǎng)時間等因素的優(yōu)

6、化，獲得了再生頻率達90％左右的離體再生體系，可以滿足遺傳轉化的要求。研究發(fā)現(xiàn)，采用TDZ代替前人常采用的BA來與NAA配合更適于“津田”蕪菁的離體再生，適合再生的激素組合為TDZ7.0 mg/L+NAA1.0 mg/L。5.0 mg/L AgNO3對再生來講是必須的。外植體以苗齡為5d的帶柄子葉為好。采用含1.0 mg/L的2，4-D的MS培養(yǎng)基預培養(yǎng)2d可以一定程度上提高再生的頻率。
　　在已經建立的蕪菁離體再生體系的基礎上，