棉花耐鹽基因GhNHX1啟動子的克隆及功能分析.pdf

1、目前在植物基因工程中廣泛應用啟動子是組成型啟動子，例如CaMV(花椰菜花葉病毒)35S啟動子。組成型啟動子不能從時間和空間上有效的調控目的基因的表達。不加控制的、大量表達外源基因可能會對轉基因植物造成毒害，也會在能源利用上造成浪費。所以對于誘導型、組織特異型的啟動子的研究和利用就顯的尤為重要。鹽脅迫是影響植物產量的重要因素之一，目前關于鹽誘導啟動子的功能分析很少。 液泡型Na<'+>/H<'+>逆向運轉體(NHXl)是近年來分離

2、到的在植物耐鹽性中起著重要作用的一類功能蛋白。液泡型Na<'+>/H<'+>逆向運轉體蛋白體利用將液泡基質中質子順電化學梯度運出液泡，同時將胞質中的Na<'+>逆濃度梯度運入液泡內積累，這不僅能夠降低胞質內的Na<'+>以維持胞質正常的K<'+>/Na<'+>比值，還可以有效利用儲存在液泡中的Na<'+>作為滲透調節(jié)劑。 從棉花中克隆的液泡型Na<'+>/H<'+>逆向運轉體基因GhNHX1，能夠提高轉基因煙草和水稻的耐鹽性。以

3、此為基礎，本研究利用TAIL-PPCR方法克隆了GhNHX1的啟動子，并通過PCR方法獲得一系列5’端缺失片斷，將啟動子及5’端缺失片斷與報告基因GUS融合，轉化煙草懸浮細胞，利用0.1M NaCl處理轉基因細胞，發(fā)現(xiàn)該啟動子能響應鹽脅迫的誘導。同時發(fā)現(xiàn)一段響應NaCl脅迫信號誘導較強的區(qū)域。主要研究結果如下： 1．根據(jù)GhNHX1基因5’非編碼區(qū)設計特異引物，利用TAIL-PCR的方法，從棉花基因組中克隆了長度為1610bp的

4、DNA片斷。該DNA片斷有49個堿基和GhNHX1基因5’非編碼區(qū)重疊，認為包含GhNHX1的啟動子。基因銀行注冊號EF650649。利用PlantCARE和PLACE兩個啟動子順式元件分析網站分析啟動子，發(fā)現(xiàn)位于轉錄起始位點上游-22/-16區(qū)存在一個TATA-box(ATATAAT)，同時發(fā)現(xiàn)了鹽誘導元件G3T1GMSCAM4元件(GAAAAA)和一些冷、干旱脅迫誘導有關的順式作用元件，如MYB識別位點(AACG,WAACCA)、M

5、YC識別位點(CANNTG)。預測的結果表明克隆到的該DNA片斷具有典型啟動子的一般特征，并且可能與各種脅迫誘導有關。 2．將GhNHX1啟動子(-1561/+49)構建到植物雙元表達載體pBI121載體，替換掉35S啟動子，與報告基因GUS融合，通過農桿菌介導的轉化方法轉化煙草懸浮細胞。同時，利用PCR的方法對GhNHX1，啟動子(-1561/+49)進行5’端缺失，將5’端缺失片斷同樣構建到pBI121載體，轉化煙草懸浮細胞

6、。將所有的轉化體通過測定GUS活性來表示啟動子的活性。GUS活性測定結果表明GhNHX1啟動子是一個鹽誘導的啟動子，響應鹽脅迫信號最強的是-52/+49區(qū)域，最強誘導比值達3.72，誘導后的表達量超過了35S的表達量。 3．GhNHXl啟動子-52/-25區(qū)段連接在pBI121載體35S△46(35S啟動子3’端46堿基，基本啟動子)，與報告基因GUS融合。GUS活性測定結果表明，該區(qū)段能夠響應鹽脅迫的誘導，誘導比值2.55。

7、 4．將GhNHXl啟動子-52/-25區(qū)段標記放射性同位素<'32>P，與核蛋白結合，進行凝膠遷移滯留試驗(EMSA)，即進行聚丙稀酰胺凝膠電泳，電泳結束后放射自顯影。結果表明，-52/-25區(qū)段能夠和核蛋白特異結合，進一步說明該DNA區(qū)段可能具有轉錄調控的功能。 5．GhNHXl啟動子-183/+49區(qū)段構建到pBI121載體，替換35S啟動子，與報告基因GUS融合，轉化煙草愈傷，培養(yǎng)成苗，然后進行GUS染色，分析Gh