津田蕪菁花青素調(diào)控基因的克隆及轉(zhuǎn)化菊花的研究.pdf

1、生物體內(nèi)從苯丙氨酸到花青素的生物合成是一系列的酶催化反應(yīng)。編碼這些酶的結(jié)構(gòu)基因要受到調(diào)節(jié)基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,以實現(xiàn)其時空特異性的表達(dá),進(jìn)而調(diào)控花青素的生物合成。已經(jīng)鑒定的在花青素途徑中起作用轉(zhuǎn)錄因子家族有:WRKY、Zn-finger、BZIP、MADS-box、MYB、bHLH、WD40等。從擬南芥、矮牽牛、玉米中所做的研究表明,花青素合成的晚期途徑需要有MYB、bHLH、WD40三類蛋白的共同參與?？股睾Y選在菊花轉(zhuǎn)基因研究中

2、已有廣泛的應(yīng)用,而糖篩選卻顯有報道。本研究以津田蕪菁(Brassica rapa L.‘Tsuda’)為試材進(jìn)行了晚期基因的克隆及表達(dá)分析,并采用抗生素與糖篩選系統(tǒng)將克隆到的PAP1基因轉(zhuǎn)化到露地菊(Dendranthema×gandiflorum)“火焰”中。
　　 通過RT-PCR、RACE(rapid amplification cDNA end)的方法從津田蕪菁中克隆到了四個花青素途徑的晚期基因:MYB類的PAP1,bH

3、LH類的EGL3、TF8,WD40類的TTG1。對克隆到的基因進(jìn)行的生物信息學(xué)分析表明:PAP1一種R2R3-MYB蛋白,含有屬于SANT超家族的保守區(qū)域,其中含有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域;EGL3與TT8含有屬于HLH超家族的保守區(qū)域,其中含有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、E-box特異性位點(diǎn)、二聚界面;TTG1含有屬于WD40超家族的保守區(qū)域。
　　 通過Real-time PCR的方法分析了生長至3個月大蕪菁各組織中克隆基因的表達(dá)情況及膨大下

4、胚軸白色表皮中調(diào)控基因在UV-A誘導(dǎo)下表達(dá)特性。Real-time PCR表明:四個調(diào)控基因在花青素合成的紅根皮部位處在一種高表達(dá)的狀態(tài);在UV-A誘導(dǎo)下,它們的表達(dá)量隨著時間的延長而升高,但I(xiàn)TG1不是很明顯。已有的研究表明津田蕪菁的花青素合成受UVA的特異誘導(dǎo),這說明了這四個基因在花青素合成中起作用。
　　 通過Gateway技術(shù)將PAP1基因構(gòu)建到了三種不同的目的載體pH7WG2D,pCAMBIA-1301-PMI,pCA