Cajal間質(zhì)細(xì)胞及c-kit、SCF基因在慢傳輸性便秘發(fā)病中的作用研究.pdf

1、慢傳輸性便秘(STC)是較常見的一類功能性頑固性便秘，發(fā)病機(jī)制不清，保守治療對STC效果有限，嚴(yán)重者最終只有手術(shù)切除全(次全)結(jié)腸。近年來的研究證實(shí)Cajal間質(zhì)細(xì)胞(ICC)是介于腸神經(jīng)系統(tǒng)和平滑肌細(xì)胞之間的一類極其特殊的間質(zhì)細(xì)胞，是胃腸道慢波的起搏細(xì)胞，對腸神經(jīng)信號傳遞到平滑肌起重要的調(diào)控作用，探索ICC的病理變化可望成為STC發(fā)病機(jī)制研究的突破點(diǎn)。c-kit是ICC的特異性標(biāo)志物，屬受體酪氨酸激酶家族第三亞類，與其配體干細(xì)胞因子(

2、stemcellfactor，SCF)結(jié)合后所啟動(dòng)的信號通路，對ICC的發(fā)育、分化及表型維持至關(guān)重要。用中和抗體阻斷c-kit與SCF結(jié)合可導(dǎo)致ICC數(shù)目減少，腸道慢波消失。c-kit基因失功能性突變(lossoffunctionmutation)也可導(dǎo)致ICC缺失。國外有少量初步的研究發(fā)現(xiàn)STC患者結(jié)腸ICC明顯減少，但I(xiàn)CC減少的原因和機(jī)制并不清楚，國內(nèi)尚未見到類似的報(bào)道。那么，STC患者結(jié)腸ICC的形態(tài)和分布究竟發(fā)生了怎樣的變化?

3、這種異常改變是否與c-kit、SCF基因異常表達(dá)或者失功能性突變有關(guān)?迄今國內(nèi)外未見報(bào)道。 目的： 1.研究STC患者乙狀結(jié)腸ICC的分布、形態(tài)和數(shù)量變化，探討STC結(jié)腸ICC形態(tài)和數(shù)量異常變化與細(xì)胞變性、凋亡、壞死是否有關(guān)。從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平探討c-kit、SCF基因表達(dá)在STC結(jié)腸ICC異常變化中的作用。 2.初步檢測STC患者c-kit基因第9～21外顯子及部分相鄰的內(nèi)含子基因序列變異(突變)情況，檢測SCF

4、基因第54號氨基酸多態(tài)位點(diǎn)在STC患者中的變化，為今后大規(guī)模的分子流行病學(xué)調(diào)查奠定基礎(chǔ)。 方法： 收集我院1995年以來手術(shù)治療的STC患者17例(基因測序部分包括了近期的6例，為23例)，在常規(guī)光鏡檢查的基礎(chǔ)上，采用免疫組織化學(xué)方法觀察乙狀結(jié)腸ICC的分布和形態(tài)變化；進(jìn)一步采用免疫熒光染色結(jié)合激光共聚焦顯微鏡技術(shù)分析ICC的數(shù)量變化；采用TUNEL染色方法進(jìn)行原位細(xì)胞凋亡檢測；透射電鏡觀察ICC超微結(jié)構(gòu)變化。對收集的1

5、2例冷凍組織標(biāo)本采用RT-PCR法檢測c-kit和SCFmRNA的表達(dá)變化；采用Westernblot法檢測c-kit和SCF蛋白表達(dá)的變化。提取冷凍標(biāo)本或者石蠟包埋組織DNA樣品，PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物純化后，對c-kit第9～21外顯子區(qū)域和SCF第8外顯子區(qū)域基因序列進(jìn)行DNA直接測序。 結(jié)果： 1.HE染色常規(guī)光鏡觀察顯示，多數(shù)STC患者結(jié)腸黏膜層呈輕度慢性炎癥，肌間神經(jīng)叢和肌層未見明顯異常。 2.免疫組化結(jié)果

6、顯示，結(jié)腸ICC主要包括四個(gè)部分，即黏膜下環(huán)肌層表面ICC、環(huán)肌層ICC、肌間叢區(qū)域ICC和縱肌層ICC，形態(tài)上可分為雙極細(xì)胞和多突起細(xì)胞。STC患者乙狀結(jié)腸各部分ICC均顯著減少，殘存的ICC突起變短、變鈍，部分患者環(huán)肌層和黏膜下環(huán)肌層表面ICC幾乎消失。 3.免疫熒光染色激光共聚焦掃描分析結(jié)果顯示，STC組ICC平均陽性面積百分比在黏膜下環(huán)肌層表面為0.97％，環(huán)肌層為2.03％，肌間叢為4.41％，縱肌層為1.59％，與對

7、照組相比均顯著降低(p＜0.05)。 4.原位細(xì)胞凋亡檢測顯示，STC患者乙狀結(jié)腸黏膜層和黏膜下層凋亡細(xì)胞增加(p=0.002)，但肌層及肌間神經(jīng)叢等區(qū)域無顯著變化(p=0.142)。 5.超微結(jié)構(gòu)觀察見STC患者乙狀結(jié)腸ICC明顯減少，ICC與平滑肌細(xì)胞之間距離增大，未見到明顯的壞死細(xì)胞和凋亡小體。 6.RT-PCR結(jié)果顯示，STC患者乙狀結(jié)腸c-kitmRNA表達(dá)顯著降低(p=0.025)；SCFmRNA表達(dá)

8、無明顯變化(p=0.122)。 7.STC患者乙狀結(jié)腸c-kit和SCF蛋白表達(dá)均顯著下降(p=0.020，p=0.031)，提示STC患者結(jié)腸ICC數(shù)量和形態(tài)異常變化與c-kit和SCF基因在轉(zhuǎn)錄和(或)翻譯水平的下調(diào)有關(guān)。 8.STC患者c-kit基因第9～21外顯子DNA直接測序發(fā)現(xiàn)存在以下堿基變異：75515T＞C，75794T＞A，81240G＞A，81517C＞T,85240A＞G,86548T＞A。其中75

9、794T＞A堿基替換，86548T＞A堿基雜合突變，可能影響mRNA剪切，與STC發(fā)病的關(guān)系值得進(jìn)一步關(guān)注。 9.STC患者SCF基因第54號氨基酸SNP位點(diǎn)檢測與對照組無差異。 結(jié)論： 1.免疫組化觀察，免疫熒光及激光共聚焦顯微鏡掃描分析發(fā)現(xiàn)STC結(jié)腸黏膜下環(huán)肌層表面ICC、環(huán)肌層ICC、肌間叢ICC和縱肌層ICC均顯著減少，殘存的ICC突起變短、變鈍。表明ICC數(shù)量減少和形態(tài)異常在STC的發(fā)病機(jī)制中扮演了重要

10、的角色。 2.STC結(jié)腸在HE染色常規(guī)光鏡下觀察肌層細(xì)胞無明顯變性和壞死表現(xiàn)，原位細(xì)胞凋亡檢測顯示STC患者結(jié)腸肌層及肌間神經(jīng)叢等區(qū)域無顯著差異；超微結(jié)構(gòu)觀察見ICC與平滑肌細(xì)胞間距增大，但未見到明顯的細(xì)胞變性和凋亡。提示：STC結(jié)腸ICC數(shù)量減少與細(xì)胞變性、壞死、凋亡關(guān)系不大。 3.RT-PCR結(jié)果和Westernblot結(jié)果顯示，STC患者乙狀結(jié)腸c-kitmRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低，SCF蛋白表達(dá)顯著下降。提示S

11、TC患者結(jié)腸ICC數(shù)量和形態(tài)異常變化與c-kit和SCF基因在轉(zhuǎn)錄和(或)翻譯水平的異常表達(dá)有關(guān)。 4.STC患者c-kit基因第9～21外顯子DNA直接測序發(fā)現(xiàn)存在以下堿基變異：75515T＞C，75794T＞A，81240G＞A，81517C＞T,85240A＞G,86548T＞A。其中75794T＞A堿基替換，86548T＞A堿基雜合突變等位基因頻率顯著升高，可能影響mRNA剪切，與STC發(fā)病的關(guān)系值得進(jìn)一步關(guān)注。SCF基