體外培養(yǎng)小鼠小腸Cajal間質(zhì)細胞及SCL轉(zhuǎn)基因?qū)ζ浔磉_c-kit的影響.pdf

1、Cajal間質(zhì)細胞(ICC)是胃腸慢波的起搏細胞(pacemakercells)[1-4]。ICC缺失與糖尿病性胃腸動力紊亂、慢傳輸性便秘、慢性假性腸梗阻等眾多胃腸動力紊亂性疾病密切相關(guān)[5，6]。酪氨酸激酶受體c-kit是胃腸道ICC的特異性標(biāo)志，干細胞因子(stemcellfactor，SCF)與c-kit結(jié)合后所啟動的信號通路，對ICC發(fā)育、分化及表型維持穩(wěn)定至關(guān)重要[8-10]。多種外源性因素均可通過下調(diào)c-kit表達使ICC失

2、去正常的表型特征，如對c-kit反應(yīng)呈陰性，而對部分平滑肌抗原反應(yīng)呈陽性，細胞突起變短或消失，ICC數(shù)目減少并直接導(dǎo)致胃腸道平滑肌慢波喪失，但并未發(fā)現(xiàn)細胞凋亡或壞死[6，11，12]。如何使發(fā)生表型轉(zhuǎn)化的ICC通過重建c-kit信號通路實現(xiàn)表型逆轉(zhuǎn)，是醫(yī)學(xué)工作者面臨的一個難題。 相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，c-kit轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)存在核轉(zhuǎn)錄因子SCL結(jié)合位點，SCL主要是通過作用于c-kit基因啟動子調(diào)節(jié)c-kit表達來發(fā)揮其“生存基因”的功能，

3、其對SCF依賴型細胞以及CD34(CD34+)陽性細胞的生存具有重要的調(diào)控作用，可強烈上調(diào)造血細胞、多種干細胞以及其他多種CD34+細胞表達c-kit[4，13-15]，CD34+的TL-1細胞轉(zhuǎn)染反義SCLcDNA后c-kit表達明顯降低，并對SCF失去反應(yīng)性，而SCL過表達則可使c-kit表達升高并對SCF反應(yīng)性恢復(fù)正常，可見SCL在c-kit表達調(diào)控中發(fā)揮重要作用[35-37]。ICC是SCF依賴型且CD34+的細胞，但目前尚無有

4、關(guān)SCL對ICC表達c-kit調(diào)控作用的報道。我們由此設(shè)想，通過上調(diào)體外培養(yǎng)ICC內(nèi)SCL表達和活性水平，達到促進ICC表達c-kit的目的，從而為通過重建c-kit信號通路促進表型受損ICC恢復(fù)表型奠定基礎(chǔ)。 體外培養(yǎng)ICC方法是研究細胞功能以及細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制的重要方法，相對體內(nèi)研究而言影響因素單一[16]。目前，有關(guān)ICC的體外培養(yǎng)，國外的研究尚少，國內(nèi)尚未見報道。在本課題研究，我們擬在建立ICC體外培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上，構(gòu)建

5、SCL表達載體，并通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)上調(diào)體外培養(yǎng)小鼠小腸ICC內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子SCL蛋白表達水平和轉(zhuǎn)錄活性，進而探討SCL轉(zhuǎn)基因?qū)w外培養(yǎng)小鼠小腸ICC表達c-kit的影響。本研究有望為從核轉(zhuǎn)錄水平治療以ICC減少為背景的胃腸動力紊亂性疾病奠定理論基礎(chǔ)。 目的： 1.建立體外培養(yǎng)ICC的方法，探討影響ICC分離、培養(yǎng)的關(guān)鍵因素，觀察其形態(tài)學(xué)特征和功能； 2.構(gòu)建核轉(zhuǎn)錄因子SCL的真核表達載體，探討SCL轉(zhuǎn)基因后對ICC表

6、達c-kit的影響。 方法： 采用酶消化法結(jié)合密度離心法分離、培養(yǎng)小鼠小腸ICC，c-kit免疫熒光染色對其進行鑒定；從防止污染、保護ICC功能、促進ICC生長和表型維持等方面探討影響體外分離、培養(yǎng)ICC的關(guān)鍵因素；激光共聚焦顯微鏡和常規(guī)顯微鏡下觀察體外培養(yǎng)小鼠小腸ICC的形態(tài)學(xué)特征；應(yīng)用Ca2+熒光指示劑Fluo-4AM細胞染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察體外培養(yǎng)小鼠小腸ICC鈣離子的分布及其振蕩功能，并觀察大黃素對ICC

7、鈣離子振蕩的影響。構(gòu)建SCL表達載體pIRES2-EGFP-SCL，并進行酶切和測序鑒定。Cy3標(biāo)記的SCL抗體進行免疫熒光染色后，激光共聚焦顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-SCL對體外培養(yǎng)小鼠小腸ICC表達SCL蛋白的影響；凝膠遷移阻滯法檢測SCL轉(zhuǎn)基因?qū)CC內(nèi)SCL結(jié)合活性的影響；Westernblot檢測轉(zhuǎn)染SCL基因?qū)w外培養(yǎng)小鼠小腸ICC表達c-kit的影響。 結(jié)果： 1.應(yīng)用ICC特異的c-kit單

8、克隆抗體進行免疫熒光鑒定，結(jié)果顯示，c-kit在培養(yǎng)細胞陽性表達。體外培養(yǎng)小鼠小腸ICC存在明顯的形態(tài)學(xué)特征，ICC接種后24h即可貼壁，細胞最初呈三角形或梭形，并有少量短突起。隨著時間的延長，細胞會形成與軸突狀長突起。體外培養(yǎng)3d，ICC即可形成較長的突起，并與周圍細胞形成突觸連接。體外培養(yǎng)7d后，ICC可以伸出二級、三級突起，相互連接ICC突起可形成復(fù)雜的網(wǎng)狀連接。ICC在體外可穩(wěn)定培養(yǎng)至少30d以上。 2.應(yīng)用Ca2+熒光

9、指示劑Fluo-4AM進行細胞染色后提示，Ca2+是ICC間連接的重要成分；體外培養(yǎng)小鼠小腸ICC具有鈣離子振蕩功能，頻率約為22次/min。大黃素可以顯著增強ICC鈣離子振蕩的振幅、頻率(約為34次/min)。 3.核轉(zhuǎn)錄因子SCL表達載體pIRES2-EGFP-SCL，酶切鑒定和基因測序比對結(jié)果與目的基因一致，Genebank比對結(jié)果提示與小鼠具有高度的同源性。轉(zhuǎn)染試劑Genejammer能將核轉(zhuǎn)錄因子SCL表達載體高效率的

10、轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)小鼠小腸ICC。 4.應(yīng)用SCL抗體免疫熒光染色提示，正常培養(yǎng)ICC內(nèi)SCL輕度表達。SCL轉(zhuǎn)基因后，ICC內(nèi)SCL蛋白表達明顯增強(p＜0.05)。EMSA結(jié)果提示，體外培養(yǎng)小鼠小腸ICC內(nèi)SCL處于輕度活化狀態(tài)，轉(zhuǎn)基因后，ICC內(nèi)SCL的DNA結(jié)合活性明顯提高(p＜0.05)。 5.Westernblot檢測結(jié)果顯示，c-kit在體外培養(yǎng)小鼠小腸ICC呈陽性表達，SCL轉(zhuǎn)基因后ICC表達c-kit較正常對

11、照組和空白質(zhì)粒對照組顯著增強(p＜0.05)。 結(jié)論： 1.我們成功建立了體外培養(yǎng)小鼠小腸ICC的方法，在細胞分離、培養(yǎng)過程有許多環(huán)節(jié)需要探討，主要包括：避免污染，減少在有害環(huán)境的時間，避免過度牽拉，及時換液，外源性SCF是穩(wěn)定細胞表型和促進ICC生長的關(guān)鍵。 2.體外培養(yǎng)小鼠小腸ICC存在明顯的形態(tài)學(xué)特征，ICC突起逐漸變多，變長，并最終可以形成類似于體內(nèi)的廣泛的連接以及網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)。體外培養(yǎng)的ICC具有鈣離子振