SHIP基因在慢性粒細(xì)胞白血病發(fā)病中的作用及機(jī)制探討.pdf

1、背景：慢性粒細(xì)胞白血?。╟hronic myelogenous leukemia）是一種獲得性多功能造血干細(xì)胞突變后克隆性惡性增生性疾病。CML的全球年發(fā)病率約為1/10萬人口，占全部成人白血病的15％-20％。我國CML的年發(fā)病率為0.36/10萬人口，僅次于急性髓系白血病和急性淋巴細(xì)胞白血病位居第3位。
　　 近年來，隨著分子生物學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)研究的不斷進(jìn)步，CML的病因?qū)W有了很大進(jìn)展，尤其是Ph染色體，bcr/abl融合基因

2、的發(fā)現(xiàn)及其相關(guān)研究，為慢性粒細(xì)胞性白血病病因診斷及治療作出了很大貢獻(xiàn)。Bcr/abl是一種抑制凋亡的基因，能通過抑制細(xì)胞凋亡，而使細(xì)胞數(shù)量增加，基因組的內(nèi)在不穩(wěn)定性增加，使細(xì)胞容易發(fā)生第二次突變，bcr/abl造成粒細(xì)胞惡性增殖的確切機(jī)制至今未完全明了。SHIP基因是近年新發(fā)現(xiàn)的一種bcr/abl下游底物，該基因僅在造血細(xì)胞表達(dá)，是PI3K/Akt信號通路的負(fù)調(diào)控因子。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)急性白血病患者存在SHIP基因突變，但SHIP基因

3、在CML發(fā)病中的作用，尤其是有關(guān)臨床方面的研究國內(nèi)外尚無報道。本研究擬檢測SHIP基因在慢性粒細(xì)胞性白血病患者的表達(dá)，探討SHIP基因在bcr/abl惡性轉(zhuǎn)化中的作用。共分四部分：1、FQ-PCR檢測不同時期慢性粒細(xì)胞白血病患者SHIP基因表達(dá)變化；2、應(yīng)用干擾RNA技術(shù)封閉人白血病細(xì)胞系K562中bcr/abl基因后觀察SHIP基因的表達(dá)變化；3、應(yīng)用SHIP基因敲除小鼠檢測SHIP基因缺失對小鼠造血功能的影響；4、通過對PI3K/A

4、kt途徑中Akt磷酸化水平的變化來了解SHIP在影響細(xì)胞凋亡中的機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.實(shí)時熒光定量PCR（FQ-PCR）檢測CML患者SHIP基因表達(dá)情況；
　　 2.合成bcr/abl基因的特異性siRNA，并轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞；
　　 3.構(gòu)建SHIP-/-轉(zhuǎn)基因骨髓受體小鼠，比較野生型和敲除SHIP基因骨髓小鼠的外周血常規(guī)、脾臟細(xì)胞學(xué)、克隆形成及骨髓細(xì)胞遷移能力改變；AnnexV/PI染色比

5、較野生型（SHIP+/+）和SHIP-/-小鼠骨髓細(xì)胞的凋亡情況；
　　 4.Western blot檢測敲除SHIP基因小鼠骨髓細(xì)胞Akt磷酸化水平。
　　 結(jié)果:
　　 1.SHIP基因在CML患者表達(dá)減低:FQ-PCR結(jié)果顯示與正常人相比，CML患者SHIP mRNA表達(dá)明顯減低。
　　 2.bcr/abl融合基因抑制SHIP基因及蛋白表達(dá)
　　 2.1封閉bcr/abl融合基因后K562細(xì)

6、胞SHIP mRNA表達(dá)增加：應(yīng)用干擾RNA技術(shù)封閉K562細(xì)胞中bcr/abl融合基因的表達(dá)后，基因表達(dá)水平較空白對照組及非特異性干擾組減低，SHIP基因mRNA的表達(dá)水平增加。分別為：bcr/abl基因：特異性siRNA干擾組（5.63±0.97）×105；空白對照組：（27.14±3.05）×105；非特異siRNA轉(zhuǎn)染組：（22.42±2.15）×105]；空白對照組與非特異性轉(zhuǎn)染組間無統(tǒng)計學(xué)意義；SHIP基因：特異性siRNA

7、封閉組（3.58±0.37）×105]，空白對照組[（1.52±0.37）×105]，非特異性siRNA組[（1.53±0.20）×105拷貝]，空白對照組非特異性siRNA干擾組表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 2.2封閉融合基因后K562細(xì)胞中SHIP蛋白表達(dá)增高：轉(zhuǎn)染特異性siRNA后K562細(xì)胞中融合蛋白p210表達(dá)明顯降低，轉(zhuǎn)染非特異性siRNA組p210表達(dá)無顯著變化。SHIP蛋白p145在空白對照及非特異性siRNA組中幾

8、乎無表達(dá)，特異性siRNA封閉p210后SHIP蛋白表達(dá)顯著增加。
　　 3.敲除SHIP基因骨髓受體小鼠出現(xiàn)了類似白血病的臟器侵潤及相關(guān)血液學(xué)變化
　　 3.1 SHIP-/-小鼠出現(xiàn)類似白血病臟器浸潤的表現(xiàn)：移植后3個月后，SHIP基因敲除骨髓受體小鼠部分出現(xiàn)了下肢癱瘓的特殊表現(xiàn)，表現(xiàn)為軟癱，不能支撐體重，對疼痛的反應(yīng)與對照組小鼠無明顯差別，提示僅為運(yùn)動功能受損，此現(xiàn)象與臨床白血病患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤的表現(xiàn)極為相似。

9、另外解剖小鼠發(fā)現(xiàn)，基因敲除骨髓受體小鼠肺臟和脾臟體積均較野生型增大。
　　 3.2敲除SHiP基因小鼠外周血中性粒細(xì)胞比例明顯增加：SHIP基因敲除小鼠的外周血中性粒細(xì)胞比例明顯增加，但早期細(xì)胞比例并不高。外周血中未發(fā)現(xiàn)有原、早幼粒細(xì)胞。血常規(guī)檢測發(fā)現(xiàn)兩種小鼠外周血中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞比例有所不同而白細(xì)胞總數(shù)無顯著差異。
　　 3.3組織學(xué)表現(xiàn)為肺臟、脾臟中中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞高度浸潤：與野生型小鼠相比，SHIP-/-小

10、鼠肺臟部分區(qū)域明顯實(shí)變，顯微鏡下觀察實(shí)變區(qū)有髓系細(xì)胞浸潤，浸潤的細(xì)胞主要集中在肺泡區(qū)，部分區(qū)域還有氣管腔內(nèi)中性粒細(xì)胞的浸潤。脾臟結(jié)構(gòu)明顯受損，正常淋巴細(xì)胞生發(fā)中心消失紅髓白髓界限消失。為大量髓系細(xì)胞侵潤。
　　 3.4細(xì)胞學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)SHIP基因缺失骨髓受體小鼠脾臟中性粒細(xì)胞比例明顯增加；外周血中性粒細(xì)胞比例亦增高：與正常小鼠脾臟細(xì)胞相比，SHIP基因缺失骨髓受體小鼠的脾臟和外周血中性粒細(xì)胞比例明顯增加，但外周血中未發(fā)現(xiàn)幼稚細(xì)胞。

11、
　　 3.5免疫學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)SHIP基因缺失骨髓受體小鼠骨髓、外周血及脾臟的髓系細(xì)胞尤其是中性粒細(xì)胞比例均顯著增加：用髓系細(xì)胞表面標(biāo)志Gr-1和Mac-1進(jìn)行免疫學(xué)標(biāo)定，進(jìn)一步證實(shí)了上述組織器官中髓系細(xì)胞的含量變化，其結(jié)果顯示SHIP基因缺失小鼠骨髓髓系細(xì)胞（Gr1+Mac1+）（40.38±0.87）％比wild-type（WT）小鼠（20.91±1.11）％增加近1倍。脾臟的髓系細(xì)胞（14.47±0.67）％增加更明顯，為W

12、T（3.49±0.47）％的4倍左右。外周血髓系細(xì)胞比例（60.71±1.72）％也比WT小鼠（23.38±0.62）％明顯增多。
　　 3.6克隆培養(yǎng)證實(shí)敲除SHIP基因?qū)е滦∈蠊撬杷柘导?xì)胞增殖增加：敲除SHIP基因小鼠骨髓單位細(xì)胞數(shù)形成克隆數(shù)量明顯多于野生型小鼠，提示該組細(xì)胞中的干祖細(xì)胞比例高于野生型小鼠。比較兩種小鼠克隆形成比例，混合克隆與粒單克?。–FU-MIX、 CFU-GM）的比例在基因敲除小鼠多于野生型小鼠，形成的

13、克隆也比野生型大，提示敲除SHIP基因?qū)е滦∈蠊撬杓?xì)胞增殖能力增強(qiáng)。
　　 3.7 Transwell實(shí)驗證實(shí)敲除SHIP基因使小鼠骨髓細(xì)胞運(yùn)動能力增強(qiáng)：敲除SHIP基因的小鼠骨髓低密度細(xì)胞跨膜運(yùn)動能力明顯增強(qiáng)，3組敲除SHIP基因細(xì)胞平均跨膜細(xì)胞數(shù)（0.35×105/2×105）明顯多于野生型小鼠（0.07×105/2×105）。
　　 3.8敲除SHIP基因?qū)е滦∈蠊撬杓?xì)胞對無血清饑餓誘導(dǎo)凋亡耐受力增強(qiáng)：36小時無血

14、清培養(yǎng)后，流式細(xì)胞學(xué)檢測凋亡率發(fā)現(xiàn)，SHIP-/-的小鼠骨髓單個核細(xì)胞凋亡率（3.86±0.28）明顯低于對照組細(xì)胞（19.6±1.28）。提示SHIP基因缺失導(dǎo)致小鼠細(xì)胞抗凋亡能力增強(qiáng)。
　　 4.SHIP基因缺失細(xì)胞內(nèi)Akt磷酸化水平升高：Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，在SHIP基因缺失的小鼠骨髓細(xì)胞中，其Akt的磷酸化水平明顯增加，其在未受任何刺激情況下就有明顯的p-Akt出現(xiàn)，在受到GM-CSF刺激的情況下表現(xiàn)更為明

15、顯，提示SHIP能夠抑制Akt的磷酸化。
　　 結(jié)論:
　　 1.SHIP基因在CML患者中表達(dá)減低甚至表達(dá)缺失。
　　 2.Bcr/abl融合基因抑制SHIP基因表達(dá)。
　　 3.敲除SHIP基因可促進(jìn)造血細(xì)胞中髓系細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞的運(yùn)動侵襲能力。敲除SHIP基因可使細(xì)胞內(nèi)磷酸化Akt水平增加，并對GM-CSF的反應(yīng)增強(qiáng)。
　　 4.SHIP基因通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt途徑發(fā)揮其