非小細(xì)胞肺癌腫瘤間質(zhì)T淋巴細(xì)胞亞群活性及臨床意義.pdf

1、研究背景:
　　 惡性腫瘤在本世紀(jì)及未來的一段時(shí)期內(nèi)仍將是嚴(yán)重威脅人類健康的重要疾病。在我國大中城市和西方國家，肺癌的發(fā)病率和死亡率仍居各種惡性腫瘤的首位。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，全世界每年估計(jì)有超過120萬新發(fā)肺癌患者，死亡約110萬人。但就肺癌而言80％患者發(fā)現(xiàn)已屬中晚期，5年平均生存率僅有20％。國際上目前在腫瘤的基礎(chǔ)研究領(lǐng)域已取得了許多實(shí)質(zhì)性的成果，但臨床工作中尚缺乏能有效篩查，隨訪和判斷預(yù)后的腫瘤分子生物學(xué)標(biāo)志物，腫瘤的免疫逃逸

2、機(jī)制尚不確定。
　　 腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及免疫逃逸與機(jī)體免疫機(jī)能密切相關(guān)。機(jī)體免疫機(jī)能的有效執(zhí)行則是建立于淋巴細(xì)胞各亞群之間比例關(guān)系及功能正常的前提基礎(chǔ)上。因此淋巴細(xì)胞是腫瘤間質(zhì)中是最重要的細(xì)胞，與患者病情進(jìn)展和預(yù)后密切相關(guān)，其活性和功能發(fā)生相應(yīng)改變，導(dǎo)致了疾病進(jìn)展和預(yù)后向著完全相反的轉(zhuǎn)歸。因此可望通過恢復(fù)其所具有的主動(dòng)調(diào)控癌細(xì)胞生存和轉(zhuǎn)移能力，從而達(dá)到“重建”抗腫瘤免疫功能。
　　 研究目的:
　　 1、探討超低

3、溫冰凍保存組織行石蠟包埋后行免疫組化染色的可行性及實(shí)驗(yàn)方法的探索。
　　 2、利用已制備腫瘤及瘤旁組織石蠟?zāi)K進(jìn)行T淋巴細(xì)胞各亞群免疫組化染色，探討癌癥分期與腫瘤微環(huán)境內(nèi)T淋巴細(xì)胞亞群改變的關(guān)聯(lián)性。
　　 3、探討CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)增殖與癌細(xì)胞免疫逃逸的關(guān)系。
　　 實(shí)驗(yàn)對(duì)象和方法
　　 一、實(shí)驗(yàn)對(duì)象：
　　 我院2009年5

4、月至11月間60例經(jīng)術(shù)后病理確診為非小細(xì)胞肺癌患者的新鮮腫瘤組織及瘤旁組織標(biāo)本。其中男性32例，女性28例，年齡47歲～77歲，中位年齡62歲。術(shù)后按1997年國際抗癌聯(lián)盟(UICC)修訂的肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期8例，Ⅱ期26例，Ⅲ期21例，Ⅳ期5例。術(shù)前均未接受過化、放療。術(shù)中取材包括無明顯出血壞死的腫瘤組織，及肉眼可辨鄰近腫瘤的正常肺組織作為瘤旁組織。
　　 二、肺癌病人組織取材及保存：
　　 術(shù)中瘤體離體后30m

5、in內(nèi)，取瘤體及瘤旁組織各一塊，直徑約1×1cm，剔除壞死組織及血凝塊后，予以-196℃液氮速凍后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱恒溫保存。
　　 三、冰凍組織的石蠟?zāi)K構(gòu)建：
　　 冰凍組織依特定條件梯度復(fù)溫后置入多聚甲醛溶液中，常規(guī)脫水，透明后石蠟包埋1.5×1.5cm蠟塊。
　　 四、組織切片及免疫組化染色：
　　 將每個(gè)腫瘤及瘤旁組織標(biāo)本切取4μm厚白片4張，其中兩張為連續(xù)切片，分別行CD3、CD8，連續(xù)切片行C

6、D4及CD25/Foxp3染色。每個(gè)癌旁組織連續(xù)切片2張行CD4及CD25/Foxp3染色。
　　 五、陽性目標(biāo)細(xì)胞的判讀及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：
　　 CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞判斷標(biāo)準(zhǔn):細(xì)胞形態(tài)完整，結(jié)構(gòu)清晰，棕黃色顆粒特異定位于胞膜上。CD25+Foxp3+T細(xì)胞判斷標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞形態(tài)完整，結(jié)構(gòu)清晰，代表Foxp3+紅色顆粒定位于胞內(nèi)，代表CD25+棕黃色顆粒定位于胞膜上。CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞以兩張連續(xù)切

7、片，在相同部位出現(xiàn)CD4+、CD25+、Foxp3+三陽性標(biāo)記的細(xì)胞為目標(biāo)細(xì)胞，采用先在低倍鏡(×100倍)下觀察整張切片，隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野(400倍)，運(yùn)用Imageproplus軟件設(shè)定AOI(Area of interest)后，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，輸入采用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、Spearman秩相關(guān)分析，交叉分類2×2列聯(lián)表的關(guān)聯(lián)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　

8、　 1.超低溫冰凍保存組織行石蠟包埋免疫組化染色：
　　 臨床收集手術(shù)標(biāo)本，-196℃液氮速凍后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱恒溫保存，其中組織標(biāo)本最長(zhǎng)冰凍時(shí)間為7個(gè)月。經(jīng)過梯度降溫及多聚甲醛浸泡脫水后，按常規(guī)石蠟切片制作，HE染色組織形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，膜抗原無明顯破壞，免疫組化染色與新鮮組織石蠟切片比較無明顯差別。
　　 2.腫瘤組織微環(huán)境T淋巴細(xì)胞亞群活性：
　　 Ⅰ/Ⅱ期患者為A組，Ⅲ/Ⅳ期患者為B組，兩組非小細(xì)胞肺癌患者

9、腫瘤組織中T淋巴細(xì)胞絕對(duì)值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。B組較之A組CD4淋巴細(xì)胞亞群數(shù)目下降、CD4/CD8比值下降(P＜0.05)，Treg亞群細(xì)胞數(shù)目、CD8淋巴亞群細(xì)胞數(shù)目升高。
　　 3.CD4+CD25+Foxp3+與腫瘤分期相關(guān)性統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：
　　 Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)，相關(guān)系數(shù)rs=0.53，查rs臨界值表，r0.05，60=0.255，｜rs｜＞r0.05，60(P＜0.05)，提示腫瘤分期與

10、CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞比例呈正相關(guān)。
　　 結(jié)論:
　　 1.證實(shí)了臨床工作中經(jīng)液氮速凍后-80℃冰箱恒溫長(zhǎng)期保存的組織行石蠟切片免疫組化染色實(shí)驗(yàn)方法的可行性。且對(duì)具體實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了新的探索與改進(jìn)，使抗原保護(hù)更優(yōu)，組織結(jié)構(gòu)形態(tài)保存更完整。
　　 2.隨著腫瘤的發(fā)生發(fā)展，起輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞亞群CD4 T淋巴細(xì)胞數(shù)目下降，而起免疫抑制的作用的CD8 T淋巴細(xì)胞數(shù)目上升。
　　 3.CD4+C