非小細胞肺癌腫瘤間質(zhì)T淋巴細胞亞群活性及臨床意義.pdf

1、研究背景:
　　 惡性腫瘤在本世紀及未來的一段時期內(nèi)仍將是嚴重威脅人類健康的重要疾病。在我國大中城市和西方國家，肺癌的發(fā)病率和死亡率仍居各種惡性腫瘤的首位。據(jù)WHO統(tǒng)計，全世界每年估計有超過120萬新發(fā)肺癌患者，死亡約110萬人。但就肺癌而言80％患者發(fā)現(xiàn)已屬中晚期，5年平均生存率僅有20％。國際上目前在腫瘤的基礎研究領域已取得了許多實質(zhì)性的成果，但臨床工作中尚缺乏能有效篩查，隨訪和判斷預后的腫瘤分子生物學標志物，腫瘤的免疫逃逸

2、機制尚不確定。
　　 腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及免疫逃逸與機體免疫機能密切相關。機體免疫機能的有效執(zhí)行則是建立于淋巴細胞各亞群之間比例關系及功能正常的前提基礎上。因此淋巴細胞是腫瘤間質(zhì)中是最重要的細胞，與患者病情進展和預后密切相關，其活性和功能發(fā)生相應改變，導致了疾病進展和預后向著完全相反的轉(zhuǎn)歸。因此可望通過恢復其所具有的主動調(diào)控癌細胞生存和轉(zhuǎn)移能力，從而達到“重建”抗腫瘤免疫功能。
　　 研究目的:
　　 1、探討超低

3、溫冰凍保存組織行石蠟包埋后行免疫組化染色的可行性及實驗方法的探索。
　　 2、利用已制備腫瘤及瘤旁組織石蠟模塊進行T淋巴細胞各亞群免疫組化染色，探討癌癥分期與腫瘤微環(huán)境內(nèi)T淋巴細胞亞群改變的關聯(lián)性。
　　 3、探討CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg)增殖與癌細胞免疫逃逸的關系。
　　 實驗對象和方法
　　 一、實驗對象：
　　 我院2009年5

4、月至11月間60例經(jīng)術后病理確診為非小細胞肺癌患者的新鮮腫瘤組織及瘤旁組織標本。其中男性32例，女性28例，年齡47歲～77歲，中位年齡62歲。術后按1997年國際抗癌聯(lián)盟(UICC)修訂的肺癌TNM分期標準，Ⅰ期8例，Ⅱ期26例，Ⅲ期21例，Ⅳ期5例。術前均未接受過化、放療。術中取材包括無明顯出血壞死的腫瘤組織，及肉眼可辨鄰近腫瘤的正常肺組織作為瘤旁組織。
　　 二、肺癌病人組織取材及保存：
　　 術中瘤體離體后30m

5、in內(nèi)，取瘤體及瘤旁組織各一塊，直徑約1×1cm，剔除壞死組織及血凝塊后，予以-196℃液氮速凍后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱恒溫保存。
　　 三、冰凍組織的石蠟模塊構建：
　　 冰凍組織依特定條件梯度復溫后置入多聚甲醛溶液中，常規(guī)脫水，透明后石蠟包埋1.5×1.5cm蠟塊。
　　 四、組織切片及免疫組化染色：
　　 將每個腫瘤及瘤旁組織標本切取4μm厚白片4張，其中兩張為連續(xù)切片，分別行CD3、CD8，連續(xù)切片行C

6、D4及CD25/Foxp3染色。每個癌旁組織連續(xù)切片2張行CD4及CD25/Foxp3染色。
　　 五、陽性目標細胞的判讀及統(tǒng)計學分析：
　　 CD3+、CD4+、CD8+T細胞判斷標準:細胞形態(tài)完整，結構清晰，棕黃色顆粒特異定位于胞膜上。CD25+Foxp3+T細胞判斷標準：細胞形態(tài)完整，結構清晰，代表Foxp3+紅色顆粒定位于胞內(nèi)，代表CD25+棕黃色顆粒定位于胞膜上。CD4+CD25+Foxp3+T細胞以兩張連續(xù)切

7、片，在相同部位出現(xiàn)CD4+、CD25+、Foxp3+三陽性標記的細胞為目標細胞，采用先在低倍鏡(×100倍)下觀察整張切片，隨機選擇5個高倍視野(400倍)，運用Imageproplus軟件設定AOI(Area of interest)后，計數(shù)陽性細胞數(shù)，以均數(shù)±標準差表示，輸入采用SPSS14.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗、Spearman秩相關分析，交叉分類2×2列聯(lián)表的關聯(lián)分析，檢驗水準取α=0.05。
　　 實驗結果:
　

8、　 1.超低溫冰凍保存組織行石蠟包埋免疫組化染色：
　　 臨床收集手術標本，-196℃液氮速凍后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱恒溫保存，其中組織標本最長冰凍時間為7個月。經(jīng)過梯度降溫及多聚甲醛浸泡脫水后，按常規(guī)石蠟切片制作，HE染色組織形態(tài)結構完整，膜抗原無明顯破壞，免疫組化染色與新鮮組織石蠟切片比較無明顯差別。
　　 2.腫瘤組織微環(huán)境T淋巴細胞亞群活性：
　　 Ⅰ/Ⅱ期患者為A組，Ⅲ/Ⅳ期患者為B組，兩組非小細胞肺癌患者

9、腫瘤組織中T淋巴細胞絕對值差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。B組較之A組CD4淋巴細胞亞群數(shù)目下降、CD4/CD8比值下降(P＜0.05)，Treg亞群細胞數(shù)目、CD8淋巴亞群細胞數(shù)目升高。
　　 3.CD4+CD25+Foxp3+與腫瘤分期相關性統(tǒng)計學分析：
　　 Spearman秩相關檢驗，相關系數(shù)rs=0.53，查rs臨界值表，r0.05，60=0.255，｜rs｜＞r0.05，60(P＜0.05)，提示腫瘤分期與

10、CD4+CD25+Foxp3+T細胞比例呈正相關。
　　 結論:
　　 1.證實了臨床工作中經(jīng)液氮速凍后-80℃冰箱恒溫長期保存的組織行石蠟切片免疫組化染色實驗方法的可行性。且對具體實驗方法進行了新的探索與改進，使抗原保護更優(yōu)，組織結構形態(tài)保存更完整。
　　 2.隨著腫瘤的發(fā)生發(fā)展，起輔助/誘導T淋巴細胞亞群CD4 T淋巴細胞數(shù)目下降，而起免疫抑制的作用的CD8 T淋巴細胞數(shù)目上升。
　　 3.CD4+C