不同添加成分對(duì)凍融后人原始卵泡體外培養(yǎng)的研究.pdf

1、卵巢組織冷凍保存已經(jīng)成為生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。凍融后的卵巢組織主要用于移植或體外培養(yǎng)。對(duì)于惡性腫瘤患者來(lái)說(shuō),自體移植顯然是不合適的,而異種移植又受到倫理以及動(dòng)物源性傳染病的限制。體外培養(yǎng)又分為卵巢組織體外培養(yǎng)和卵泡體外培養(yǎng)。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明,卵巢組織體外培養(yǎng)可以保存完整的卵泡結(jié)構(gòu)以及卵泡與組織間的相互作用,成為探索新鮮或凍融卵巢組織中卵泡生長(zhǎng)發(fā)育的重要研究模型。但是,由于人卵巢皮質(zhì)中卵泡的分布不均勻,僅靠冷凍前的組織形態(tài)學(xué)分析很難

2、估計(jì)冷凍組織塊中的卵泡數(shù)量,卵巢組織塊中卵泡含量的不確定性大大降低了卵巢組織體外培養(yǎng)的價(jià)值。分離后卵泡的體外培養(yǎng)因能夠?yàn)檩o助生殖技術(shù)提供實(shí)實(shí)在在的卵母細(xì)胞來(lái)源而優(yōu)于卵巢組織體外培養(yǎng)。
　　 目的
　　 本研究采用直接覆蓋玻璃化冷凍法凍存人類卵巢組織,解凍后分離卵泡,完整存活卵泡行體外培養(yǎng),使用藻酸鈣作為三維培養(yǎng)體系,在體外培養(yǎng)液中添加干細(xì)胞因子(stem cell factor,SCF,又稱kit配體)及白血病抑制因子(

3、leukaemiainhibitory factor,LIF),以探討體外培養(yǎng)條件下LIF與SCF對(duì)人原始卵泡生長(zhǎng)發(fā)育的影響,研究最佳的體外培養(yǎng)條件。為構(gòu)建人類卵子庫(kù)提供基礎(chǔ)研究。
　　 方法：
　　 人卵巢組織冷凍方案基本參照Chen等[1]報(bào)道的直接覆蓋玻璃化冷凍方案(DCV)。
　　 1.將所收集的18例卵巢組織分割成1mm×1mm×2mm的組織塊,隨機(jī)留2～3塊新鮮組織10％中性甲醛固定,部分新鮮組織用于

4、分離卵泡,其余組織全部用于直接覆蓋玻璃化冷凍保存；
　　 2.解凍后的卵巢組織隨機(jī)留2～3塊10％中性甲醛固定,其余組織全部用于分離卵泡；
　　 3.選取形態(tài)正常的卵泡隨機(jī)分成5組,添加不同成分的培養(yǎng)液,在藻酸鈣三維培養(yǎng)體系中體外培養(yǎng)8d。隔天半量換液,收集培養(yǎng)液置于-20℃冰箱保存,采用電化學(xué)發(fā)光免疫分析法(electrochemiluminescence immunoassay,ECLIA)測(cè)定雌二醇水平；0d、4d

5、、8d測(cè)卵泡直徑；臺(tái)盼藍(lán)染色評(píng)價(jià)卵泡活率。
　　 4.采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.卵巢組織冷凍前后組間各級(jí)卵泡構(gòu)成比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),組內(nèi)各級(jí)卵泡構(gòu)成比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),人卵巢組織中的卵泡主要為原始卵泡,其次為初級(jí)卵泡和次級(jí)卵泡,未見(jiàn)竇狀卵泡,且卵泡在組織中的分布不均勻；
　　 2.冷凍前后原始卵泡中異常卵泡所占比例

6、無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。各組內(nèi)原始卵泡與初、次級(jí)卵泡相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),冷凍后初、次級(jí)卵泡的損傷程度較冷凍前增加,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；
　　 3.冷凍前后分離的卵泡絕大部分存活,冷凍過(guò)程對(duì)分離的各級(jí)卵泡的存活率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但初、次級(jí)卵泡存活率較原始卵泡存活率偏低；
　　 4.隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加,對(duì)照組卵泡直徑增長(zhǎng)緩慢,明顯小于各實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)；而

7、在實(shí)驗(yàn)組中,SCF和LIF聯(lián)合培養(yǎng)組中卵泡直徑增長(zhǎng)迅速,較單獨(dú)培養(yǎng)組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),聯(lián)合培養(yǎng)組中,不同濃度的SCF組中卵泡直徑的增長(zhǎng)速度相差不大,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；單獨(dú)SCF和LIF組相比,卵泡生長(zhǎng)速度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；
　　 5.隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加,各組卵泡都具有分泌激素的功能。4天后對(duì)照組卵泡激素水平增長(zhǎng)緩慢,明顯小于各實(shí)驗(yàn)組(P<0.05),而在實(shí)驗(yàn)組中,SCF和LIF聯(lián)合

8、培養(yǎng)組中卵泡激素分泌增長(zhǎng)迅速,較單獨(dú)培養(yǎng)組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),聯(lián)合培養(yǎng)組中,不同濃度的SCF組中卵泡的激素增長(zhǎng)速度相差不大,但在第4天差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；單獨(dú)SCF和LIF組相比,卵泡激素水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；
　　 6.體外培養(yǎng)8d后,采用臺(tái)盼藍(lán)染色評(píng)價(jià)各組卵泡的存活率,對(duì)照組的卵泡存活率明顯低于實(shí)驗(yàn)組(P<0.05),而各實(shí)驗(yàn)組相比卵泡存活率無(wú)明顯差異(P>0.05)。
　　

9、 結(jié)論：
　　 1.直接覆蓋玻璃化冷凍法操作簡(jiǎn)單,耗時(shí)短,能夠很好的保存人卵巢組織中的卵泡,可用于人類卵巢組織的冷凍保存；
　　 2.冷凍過(guò)程對(duì)原始卵泡無(wú)明顯損傷,但對(duì)初、次級(jí)卵泡可造成一定程度的損傷；
　　 3.藻酸鈣能夠維持卵泡的完整結(jié)構(gòu),維持細(xì)胞間的縫隙連接,可以作為三維培養(yǎng)體系用于分離卵泡的體外培養(yǎng)；
　　 4.酶聯(lián)合機(jī)械分離卵泡的方法可以減輕單用酶對(duì)基底膜和卵泡膜所造成的損傷,使分離的卵泡保持