豚鼠新鮮和凍融腔前卵泡體外培養(yǎng)的初步研究.pdf

1、目的：本項(xiàng)目通過(guò)分離新鮮和凍融豚鼠卵巢腔前卵泡的體外發(fā)育，比較培養(yǎng)方式、培養(yǎng)液成分、卵泡入培直徑和凍融過(guò)程對(duì)其存活率、成腔率、生長(zhǎng)速度的影響，以探討豚鼠腔前卵泡的體外培養(yǎng)體系的優(yōu)化，期望為年輕高治愈率腫瘤患者冷凍保存卵巢組織內(nèi)腔前卵泡的將來(lái)臨床應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：本研究采用酶消化結(jié)合機(jī)械分離法分離豚鼠卵巢腔前卵泡隨機(jī)分組進(jìn)行體外培養(yǎng)(除2組3組以外，其他均采用0.5％藻酸鹽微球包埋卵泡置于含0.1IU/mlFSH的

2、a-MEM培養(yǎng)液中三維培養(yǎng))，比較(1)藻酸鹽微球包埋卵泡三維培養(yǎng)和二維常規(guī)培養(yǎng)；(2)不同濃度藻酸鹽微球包埋卵泡三維培養(yǎng)；(3)添加不同濃度FSH培養(yǎng)液三維培養(yǎng)；(4)單個(gè)卵泡和多個(gè)卵泡三維培養(yǎng)；(5)腔前卵泡體外培養(yǎng)初始直徑；(6)凍融過(guò)程等對(duì)豚鼠腔前卵泡體外發(fā)育的影響，分別于培養(yǎng)0天(D0)、4天(D4)、8天(D8)和12天(D12)在倒置顯微鏡下觀察卵泡形態(tài)，卵母細(xì)胞與卵泡細(xì)胞分離情況，成腔率、OCTAX Eyeware軟件測(cè)

3、量卵泡和卵母細(xì)胞直徑變化等情況，D12采用LIVE/DEAD熒光染色共聚焦顯微鏡觀察其存活率。
　　結(jié)果：所有分離的腔前卵泡DO隨機(jī)分組體外培養(yǎng)，各組卵泡初始直徑均值無(wú)顯著差異(P>0.05)。
　　1、藻酸鹽三維培養(yǎng)和二維常規(guī)培養(yǎng)組比較：體外培養(yǎng)的腔前卵泡直徑逐漸增加，d12卵母細(xì)胞直徑藻酸鹽三維培養(yǎng)組(75.63±6.34um)比較二維培養(yǎng)組(71.03±6.45um)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；d12卵母細(xì)胞存活

4、率藻酸鹽三維培養(yǎng)組(76.8%)比較二維培養(yǎng)組(56.4%)有顯著性差異(P<0.05)；d12藻酸鹽三維培養(yǎng)組卵泡三維結(jié)構(gòu)保存完好，而二維培養(yǎng)組有66.96%卵泡發(fā)生了卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞分離。
　　2、不同藻酸鹽濃度(0.5%、1%、2%)微球包埋三維培養(yǎng)組比較：體外培養(yǎng)各時(shí)間段(D4、D8、D12)的三組(0.5%、1%、2%藻酸鹽組)卵泡直徑分別為D4組(357.53±52.79um；342.50±53.93um；332.0

5、1±65.03um)、D8組(416.33±86.02um；394.91±82.67；382.88±88.28um)、D12組(447.26±115.54um；427.41±127.01um；432.68±140.77um)，比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但體外培養(yǎng)12天后卵泡三維結(jié)構(gòu)完整性卵泡數(shù)在低濃度(0.5%)藻酸鹽微球包埋組中最高(88.99%)，僅11.11%卵泡生長(zhǎng)失去球形結(jié)構(gòu)，而1%藻酸鹽組有23.46%的卵泡失去球

6、形結(jié)構(gòu)，2％藻酸鹽組有52.81％的卵泡失去球形結(jié)構(gòu)；而D12成腔率(23.95％，20.63％，23.19％)、D12卵泡存活率(93.33％，90.00％，87.50％)、卵母細(xì)胞存活率(76.8％，68，09％，64，41％)，3組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　3、不同濃度FSH組之間的比較：對(duì)照組無(wú)添加FSH即0IU/mlFSH組卵泡生長(zhǎng)緩慢，卵泡直徑在D4、D8、D12(245.33±52.68um；26

7、6.59±86.95um；295.19±134.07um)分別與0.01IU/mlFSH組(342.70±69.29um；396.54±100.18um；413.01±141.77mn)、0.1IU/mlFSH組(357.53±52.79um；416.33±86.02um；447.26±115.54um)和1IU/mlFSH組(342.51±62.04um；413.97±99.67um；446.55±121.33um)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)

8、意義(P<0.05)；D12成腔率對(duì)照組為(2.63％)，分別與各實(shí)驗(yàn)組(0.01IU/mlFSH組、0.1IU/mlFSH組和IIU/mlFSH組)卵泡成腔率(26.32％，23.95％，26.19％)比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。而各實(shí)驗(yàn)組(0.01IU/mlFSH組、0.1IU/mlFSH組和1IU/mlFSH組)之間在D4、D8、D12的卵泡直徑和成腔率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；D12卵泡存活率，0IU/mlF

9、SH組(66.07％)與0.1IU/mlFSH組(93.33％)、1IU/mlFSH組(96.00％)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；0.01IU/mlFSH組(81.48％)與1IU/mlFSH組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其他各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；D12卵母細(xì)胞存活率，各組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　4、單個(gè)卵泡培養(yǎng)和多個(gè)卵泡培養(yǎng)組：?jiǎn)蝹€(gè)卵泡組(346.03±61.05

10、um；401.39±93.69um；430.66±121.70um)和3個(gè)卵泡組(344.54±74.89um；408.30±116.72um；437.74±157.05um)體外培養(yǎng)在D4、D8、D12分別比較，卵泡直徑差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，卵泡群培養(yǎng)D12成腔率(37.35％)高于單獨(dú)培養(yǎng)(23.95％)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，D12卵泡存活率(91.67％，93.33％)、D12卵母細(xì)胞存活率(70.18％

11、，76.8％)，兩組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　5、腔前卵泡體外培養(yǎng)初始直徑(<160um、160-220um、>220um)比較：體外培養(yǎng)12天，初始直徑160-220um卵泡組平均直徑(281.76±106.30um)增長(zhǎng)最快，與其他兩組(165.99±88.75um，184.88±113.04um)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，，<160um組與>220um組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；

12、D12成腔率，<160um組沒(méi)有成腔卵泡，與160-220um組(281.76±106.30um)，>220um組(184.88±113.04um)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，160-220um組與>220um組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。D12卵泡存活率(90.00％，92.86％，100％)、卵母細(xì)胞存活率(70.37％，85.54％，20.00％)，兩組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　5、新

13、鮮組和凍融組比較：凍融組分離得到的腔前卵泡數(shù)量(98個(gè)/卵巢)，少于新鮮組的得卵數(shù)(122個(gè)/卵巢)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。凍融組卵泡生長(zhǎng)緩慢，卵泡直徑在D4(308.89±55.37um)、D8(337.96±74.24um)、D12(339.29±77.91um)與新鮮組(357.53±52.79um、416.33±86.02um、447.26±115.54um)相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與新鮮組(23.

14、95％)比較D12凍融組成腔率低，只有1個(gè)成腔，占1.69％；凍融組卵泡存活率(80.49％)比新鮮組(100％)也較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，卵母細(xì)胞存活率(36.59％，76.8％)，兩組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、藻酸鹽微球包埋腔前卵泡三維培養(yǎng)優(yōu)于二維常規(guī)培養(yǎng)法。能夠較好維持卵泡的立體結(jié)構(gòu)完整性更有利于卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)，且藻酸鹽濃度以0.5％為佳。
　　2、豚鼠腔前卵

15、泡體外培養(yǎng)添加FSH有利于提高卵泡的生長(zhǎng)速度、存活率和成腔率。
　　3、不同的藻酸鹽包埋濃度不影響卵泡的生長(zhǎng)速度、存活率和成腔率，但高濃度的藻酸鹽包埋濃度會(huì)使卵泡失去球形結(jié)構(gòu)。
　　4、多個(gè)卵泡共同培養(yǎng)有利于提高豚鼠腔前卵泡的成腔率。
　　5、直徑160-220um的腔前卵泡更適合三維體外培養(yǎng)，具有更高的生長(zhǎng)速度和成腔率。
　　6、凍融過(guò)程致豚鼠腔前卵泡一定程度損傷，導(dǎo)致分離腔前卵泡數(shù)量減少，體外培養(yǎng)卵泡存活率、