中藥成分對TGEV體外抑制作用及機制初步研究.pdf

1、豬傳染性胃腸炎(swine transmissible gastroenteritis, TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒(swine transmissible gastroenteritisvirus, TGEV)引發(fā)的豬的一種高度傳染性豬疾病。該病毒感染可導致仔豬嚴重腹瀉、厭食、嘔吐、脫水、無力，兩周齡以下仔豬死亡率最高，是危害養(yǎng)豬業(yè)的重要病毒之一。為了探討連翹苷等中藥成分在豬感染 TGEV后，能夠發(fā)揮出怎樣的作用與機制，明確中藥成

2、分在體外作用并成功達到抗病毒的療效，本研究利用豬睪丸上皮細胞（ ST細胞）為感染模型，采用MTT比色法和細胞病變觀察法相結(jié)合，篩選出抗TGEV活性較好的中藥成分，將抗TGEV中藥成分不同作用方式下在ST細胞上與病毒結(jié)合，根據(jù)細胞形態(tài)及病毒量的變化，明確中藥成分抑制 TGEV增殖等一系列作用過程及初步原理。同時對篩選出的中藥成分進行復方組合，觀察復方中藥成分對 TGEV的作用療效，為抗TGEV的藥物篩選提供依據(jù)。主要研究內(nèi)容包括：

3、　　1.藥物活性篩選細胞模型的建立
　　對長滿單層的ST細胞感染TGEV強毒株病毒，當細胞出現(xiàn)明顯的病理變化時，通過 RNA提取試劑盒提取病毒的總 RNA，用 cDNA第一鏈合成試劑盒生成新的cDNA。以所獲得的cDNA作為PCR模版進行DNA的復制與合成，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，擴增出了條帶大小約0.75 kb的特異性片段，在最初設(shè)想的條帶大小范圍之內(nèi)。并進行 TGEV測序及同源性分析。把 TGEV培養(yǎng)液連續(xù)十倍倍比稀釋，依次接種到布

4、滿單層ST細胞的96孔板上，設(shè)置對照組，培養(yǎng)72 h，并對細胞病變情況進行每天記錄。隨后根據(jù) Karber法計算病毒半數(shù)組織細胞感染量為10-6.25/0.1 mL，用細胞維持液配成100?TCID50病毒懸液，-70℃凍存?zhèn)溆?。這些步驟為篩選抗病毒中藥成分的細胞培養(yǎng)模型創(chuàng)造了條件。
　　2.抑制TGEV增殖中藥成分的體外篩選
　　將各中藥成分在最大安全的濃度范圍內(nèi)連續(xù)2倍倍比稀釋后，依次采用先感染病毒再用藥、先用藥后進行病

5、毒感染、藥和病毒混合后感染 ST細胞三種方法來體外增殖抑制試驗，通過酶標儀測得630 nm處OD值，計算出不同作用方式下中藥成分分別對 TGEV的抑制率，篩選出抗 TGEV活性較好的中藥成分，并分別記錄抗病毒效果最佳時藥物的濃度，6種中藥成分與病毒作用后，分別測定TGEV的病毒滴度并進行分析比較、RT-PCR鑒定各個藥物成分對病毒 RNA合成的抑制效果。結(jié)果表明：6種中藥成分在 ST細胞上對 TGEV均有達到有效的增殖抑制效果，其中，咖

6、啡酸直接殺滅病毒效果最顯著。了解中藥成分抗病毒的作用方法為進一步認識中藥抗病毒的治療原理做了鋪墊。
　　3.復方中藥成分對TGEV的增殖抑制作用
　　對2中篩選的最佳抗 TGEV濃度的中藥成分進行復方組合，第一組：連翹苷和連翹苷元；第二組：連翹苷和咖啡酸；第三組：連翹苷元和咖啡酸；第四組：連翹苷、連翹苷元和咖啡酸。將抗 TGEV最佳濃度的中藥成分復方組合后與病毒混合后感染細胞，設(shè)置正常細胞對照組，病毒對照組，每組設(shè)置3個重復