多級(jí)腫瘤靶向FA-PEG-PMA-PAMAM的合成及其納米載體系統(tǒng)研究.pdf

1、納米制劑已被證明可以降低癌癥化療的毒副作用，提高治療效果，自20世紀(jì)后期開始，納米技術(shù)在腫瘤治療中的研究和應(yīng)用突飛猛進(jìn)，納米材料作為腫瘤藥物的載體也得到了空前的重視，納米藥物制劑在腫瘤治療和診斷方面顯現(xiàn)出巨大的前景。但傳統(tǒng)納米給藥系統(tǒng)存在的缺點(diǎn)也是顯而易見的，如藥物泄露、載藥量低、靶向性不足等。如何更好地實(shí)現(xiàn)抗癌藥物的腫瘤組織靶向性，是藥學(xué)界亟待解決的重要問題之一。
　　 聚酰胺胺(PAMAM)是一種樹枝狀聚合物，表面有大量的官

2、能團(tuán)可以用來進(jìn)行修飾；內(nèi)部存在著較大的孔腔，可以包埋藥物分子；分子為真正納米級(jí)，單分子即可形成納米系統(tǒng)，能夠避免納米系統(tǒng)在體內(nèi)解聚而導(dǎo)致的藥物泄漏。但PAMAM也存在納米給藥系統(tǒng)的共性問題，包括易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)吞噬，無法保證給藥系統(tǒng)在生物環(huán)境中的穩(wěn)定性，以及對(duì)腫瘤組織的靶向性差等。
　　 針對(duì)以上問題，根據(jù)腫瘤部位的病理特點(diǎn)：血管通透性增加、酸性環(huán)境以及某些腫瘤的細(xì)胞膜高度表達(dá)葉酸受體的特點(diǎn)，本課題設(shè)計(jì)了一種新型的腫瘤

3、靶向載體材料。以PAMAM為核心，利用其分子中的大量空穴提高載藥量，并可避免藥物泄漏；在PAMAM端基上連接pH敏感材料聚甲基丙烯酸酯(PMA)，使藥物在腫瘤部位pH環(huán)境中釋放，而在正常組織中不釋放；外部連接聚乙二醇(PEG)，以避開網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)的識(shí)別，達(dá)到長(zhǎng)循環(huán)的目的，同時(shí)通過EPR效應(yīng)增加在腫瘤部位的分布；以葉酸(FA)為端基進(jìn)行修飾，使給藥系統(tǒng)可主動(dòng)靶向于腫瘤細(xì)胞。通過納米材料的pH敏感靶向、納米粒的被動(dòng)靶向和葉酸介導(dǎo)的

4、主動(dòng)靶向的有機(jī)結(jié)合，提高納米給藥系統(tǒng)的腫瘤靶向性。
　　 為合成目標(biāo)聚合物，首先通過酰胺化反應(yīng)連接FA和PEG；再通過酯化反應(yīng)將小分子引發(fā)劑BDAT連接在PEG的另一端，得到大分子引發(fā)劑FA-PEG-BDAT；通過可逆-鏈斷裂轉(zhuǎn)移自由基(RAFT)聚合反應(yīng)，將甲基丙烯酸酯類單體(MA)聚合在PEG上，形成嵌段聚合物；將BDAT端氨解，暴露出巰基；在PAMAM的端氨基上連接4-戊烯酸(PA)，使端基變成雙鍵；通過巰基和雙鍵的連接，

5、將線形聚合物和PAMAM核心組裝在一起，得到目標(biāo)聚合物。通過對(duì)各步驟產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定和表征，證明合成路線可行，合成條件與產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的關(guān)系可控。
　　 根據(jù)課題設(shè)計(jì)目的，為制備在腫瘤部位(pH<6)釋放藥物，而在正常組織中(pH≈7.4)不釋放藥物的聚合物，以在不同pH介質(zhì)中的溶脹性質(zhì)為初篩指標(biāo)，考察了甲基丙烯酸-N，N-二甲基氨基乙酯(DMAEMA)與2-羥基甲基丙烯酸乙酯(HEMA)、甲基丙烯酸正丁酯(BuMA)、甲基丙烯酸己酯(

6、HMA)和甲基丙烯酸乙基己酯(EHMA)等一系列單體制備的pH敏感共聚物，篩選得到了具有較好pH敏感溶脹性的DMAEMA與BuMA、HMA、EHMA的共聚物。又以其包載紫杉醇(PTX)的納米粒在不同pH介質(zhì)中的釋放行為為指標(biāo)，確定最終的pH敏感嵌段的單體種類和比例為DMAEMA-BuMA50:50。通過對(duì)連接水溶性PEG嵌段后對(duì)聚合物pH敏感性的影響試驗(yàn)考察，發(fā)現(xiàn)連接PEG后，納米粒對(duì)PTX的釋放速度有所降低，但pH敏感性在考察范圍內(nèi)沒

7、有明顯差異，確定了PEG分子量為5000。
　　 通過釋放可逆性實(shí)驗(yàn)，比較了最終目標(biāo)聚合物為樹枝狀FA-PEG-PMA-PAMAM和中間產(chǎn)物線形材料的pH敏感釋放性能進(jìn)行了考察和比較，結(jié)果表明樹枝狀材料制備的納米粒對(duì)環(huán)境pH的響應(yīng)速度較快，釋放的可逆性優(yōu)于線形材料納米粒，驗(yàn)證了本文設(shè)計(jì)思路的合理性和可行性。通過比較實(shí)驗(yàn)，確定了納米粒的制備方法為乳化-溶劑蒸發(fā)法。采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了工藝參數(shù)，制備得到的納米粒包封率>95％，載藥量>

8、4.6％，粒徑約為100nm，分布范圍窄。通過考察在不同pH條件下粒徑的變化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)介質(zhì)的pH由7.4降為5.0時(shí)，納米粒的粒徑增大。
　　 采用抗巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)評(píng)價(jià)了納米粒的長(zhǎng)循環(huán)性能。結(jié)果顯示FA-PEG-PMA-PAMAM納米粒的抗巨噬細(xì)胞吞噬能力顯著強(qiáng)于PAMAM納米粒；連接PEG的材料抗吞噬能力均強(qiáng)于未連接PEG的材料；線形材料的抗吞噬能力強(qiáng)于樹枝狀材料；經(jīng)修飾的PAMAM強(qiáng)于PAMAM本身；葉酸的連接對(duì)抗吞噬能力沒

9、有顯著影響。從而在細(xì)胞層面上證明了制備的納米給藥系統(tǒng)具有長(zhǎng)循環(huán)性能。
　　 選擇對(duì)葉酸敏感的腫瘤細(xì)胞KB細(xì)胞，通過攝取實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了納米粒對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性。結(jié)果顯示含葉酸的納米粒在缺葉酸培養(yǎng)基和正常培養(yǎng)基中的攝取比率均較無葉酸納米粒高，趨勢(shì)為FA-PEG-PMA≈FA-PEG-PMA-PAMAM>PEG-PMA≈PEG-PMA-PAMAM>PMA≈PMA-PAMAM>PAMAMA；同種類型的球形和線性聚合物制備的納米粒之間攝取的差

10、異沒有顯著性。
　　 用小鼠成纖維細(xì)胞L929細(xì)胞評(píng)價(jià)了FA-PEG-PMA-PAMAM的細(xì)胞相容性，結(jié)果顯示，當(dāng)載體材料濃度<625μg/ml時(shí)對(duì)L929細(xì)胞不顯示毒性。
　　 對(duì)KB的體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)表明，在缺葉酸環(huán)境中，載PTX的FA-PEG-PMA-PAMAM納米粒顯示較強(qiáng)的細(xì)胞毒作用。PTX濃度為10μg/ml，相當(dāng)于載體材料濃度200μg/ml，因此給藥系統(tǒng)在安全范圍內(nèi)對(duì)腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的殺傷作用。
　　

11、 采用液質(zhì)聯(lián)用串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)測(cè)定了PTX的血藥濃度，以紫杉醇注射液和載PTX的FA-PEG-PAMAM納米粒作為對(duì)照，對(duì)載PTX的FA-PEG-PMA-PAMAM納米粒在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)行為和荷KB瘤裸鼠體內(nèi)的組織分布進(jìn)行了考察，以研究納米粒的長(zhǎng)循環(huán)和腫瘤靶向性。結(jié)果顯示，大鼠體內(nèi)納米粒的分布和消除半衰期以及體內(nèi)滯留時(shí)間均高于紫杉醇注射液，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明納米粒在體內(nèi)具有長(zhǎng)循環(huán)性。FA-PEG-PMA-PAMAM納

12、米粒的AUC>FA-PEG-PAMAM納米粒>紫杉醇注射液，提示由于FA-PEG-PMA-PAMAM的pH敏感釋藥特性使PTX在體內(nèi)的滯留時(shí)間延長(zhǎng)。組織分布結(jié)果驗(yàn)證了納米粒的長(zhǎng)循環(huán)和靶向特征。納米粒給藥后在考察的各組織器官中的分布較慢；雖然在肝、肺、腎中的分布仍較游離藥組高，但在脾中的分布兩者無差異；納米粒組PTX在腫瘤中的分布顯著高于游離藥物組。相對(duì)于紫杉醇注射液，F(xiàn)A-PEG-PMA-PAMAM納米粒的靶向效率≈3，相對(duì)于FA-PE

13、G-PAMAM納米粒，靶向效率≈1.8，說明FA-PEG-PMA-PAMAM納米粒的靶向性強(qiáng)。結(jié)合藥動(dòng)學(xué)結(jié)果，推測(cè)原因?yàn)镕A-PEG-PMA-PAMAM納米粒的pH敏感釋放性能，使其在正常組織對(duì)包載的PTX有保護(hù)作用，因而回到血循環(huán)中再度分布到腫瘤組織的機(jī)會(huì)增加。
　　 通過荷KB瘤裸鼠模型的藥效學(xué)考察，驗(yàn)證了FA-PEG-PMA-PAMAM納米粒對(duì)腫瘤的抑制作用。分別以對(duì)腫瘤體積、瘤重和臟器指數(shù)為指標(biāo)，比較了荷瘤小鼠分別給予生

14、理鹽水、紫杉醇注射液和載PTX的FA-PEG-PMA-PAMAM納米粒的藥效學(xué)。結(jié)果顯示在每次1mg/kg，給藥3～15次的劑量下，納米給藥系統(tǒng)可顯著抑制荷KB瘤裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)，抑瘤作用顯著高于紫杉醇注射液。給藥15次后，心、肝、脾、肺、腎的組織切片顯示無明顯毒性。
　　 小鼠急性毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示：載體材料的LD50為35.23mg/kg。兔血管刺激性實(shí)驗(yàn)表明空白納米?；緹o血管刺激性。
　　 以上研究結(jié)果表明，本課題設(shè)