智能靶向納米凝膠的構建及其抗腫瘤機制研究.pdf

1、惡性腫瘤是當今嚴重威脅人類健康的三大疾病之一，而傳統(tǒng)的手術切除、化療、放療三大治療方法由于缺乏靶向性，在治療腫瘤的同時對機體的正常器官組織產(chǎn)生嚴重的的毒副作用，并且，晚期轉(zhuǎn)移率高，預后多不良，其療效難以進一步提高。在腫瘤的靶向治療領域，基因治療研究正日益受到科學家的普遍關注和重視。腫瘤基因治療(tumor gene therapy)是腫瘤治療研究中的一項突破，它是伴隨著基因操作和DNA重組技術的成熟而發(fā)展起來的治療手段，首先將外源性基因

2、（基因片段、pDNA、RNA等）導入靶細胞，通過修正、補償、替代或者抑制腫瘤細胞中異常表達的基因，從而達到治療的目的，也是目前腫瘤治療研究中的熱點。
　　 腫瘤的基因治療面臨的首要技術問題是選擇一個靶向、安全、高效的載體，能夠?qū)娯撾娦缘幕驅(qū)氲桨屑毎?。傳統(tǒng)的物理導入技術有顯微注射法、電穿孔法等，雖然轉(zhuǎn)染效率比較高，但是對技術和設備要求很高，而且只能在皮膚、肌肉等有限的組織中應用，對靶細胞也有一定的損害，無法在體內(nèi)進行。病毒

3、載體（逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體及腺病毒相關的病毒載體等）雖然轉(zhuǎn)染效率較高，但是存在明顯的非靶向性、高免疫原性等缺陷，而且病毒載體的安全性問題一直備受爭議。雖然以陽離子脂質(zhì)體(liposome)為代表的非病毒載體克服了病毒載體安全性等問題，但是其血清穩(wěn)定性差、載體體系組成復雜，結構尺寸分布寬，導致其轉(zhuǎn)染效率偏低，雖然透過添加各種輔助成分（膽固醇、乳化劑和分散劑等）可以提高轉(zhuǎn)染效率，但是大量的輔劑的引進降低了其臨床應用價值。所以，設計制備

4、結構簡單、體內(nèi)外穩(wěn)定、轉(zhuǎn)染效率高、特異靶向性的新型非病毒納米載體是基因治療的關鍵。
　　 在本研究中，我們用溫度敏感性的親水化合物——N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)修飾陽離子高分子——聚乙烯亞胺(PEI，25KD)，二者形成兩親性的共聚物。該共聚物能夠隨著體積相變溫度(VPTT)約32℃，進行自組裝，形成具有核-殼結構的溫敏性的PNIPAM/PEI納米凝膠。隨后，我們通過透射電子顯微鏡(TEM)證實該納米凝膠為粒徑較窄（約30

5、0nm）、結構明確的的核-殼結構。該納米凝膠復合體明顯比PEI表面電位低，下降到約20mV，而在293T細胞中的實驗證明該納米凝膠的材料毒性較PEI明顯降低。由于PNIPAM/PEI納米凝膠復合體的大小均一（約300nm）、結構穩(wěn)定，以及較弱的表面電位（約2mV），其在含有血清的條件下，轉(zhuǎn)染效率提高了約2倍。當溫度接近腫瘤病灶部位溫度時，溫度T大于VPTT時，轉(zhuǎn)染效率提高了2倍。我們用小動物活體成像儀(Caliper Life Scie

6、nces，Hokpinton，MA)來檢測我們制備出的這種穩(wěn)定、均一的納米凝膠復合體通過尾靜脈注射方式在荷瘤裸鼠體內(nèi)24小時的富集情況。最后用我們制備出的溫敏的、在血清中具有較高穩(wěn)定性的PNIPAM/PEI納米凝膠復合體包裹、轉(zhuǎn)染蓖麻毒素A(RA)蛋白的表達質(zhì)粒pRA-EGFP。我們發(fā)現(xiàn)，制備的納米凝膠復合體可以將pRA-EGFP質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染到靶細胞，并且由于納米凝膠復合體具有在血清中高穩(wěn)定性，細胞靶向性以及增強細胞內(nèi)質(zhì)子緩沖能力等特性

7、，經(jīng)該納米凝膠復合體包裹pRA-EGFP質(zhì)粒處理后的荷瘤裸鼠乳腺腫瘤生長受到明顯抑制，其中通過尾靜脈注射方式給藥的腫瘤體積相對于對照減少了2.3倍，而通過瘤內(nèi)給藥組的腫瘤體積相對于對照組減少了5倍。我們的研究結果表明我們制備出的低毒、溫敏性的具有核-殼結構的PNIPAM/PEI陽離子納米凝膠復合體能夠成為高效的基因治療載體。
　　 本論文針對腫瘤臨床治療的問題，圍繞腫瘤微環(huán)境的特點，通過高分子設計及智能納米載體的制備，體內(nèi)外的系