還原-pH雙重響應與RGD修飾PAMAM靶向載藥系統(tǒng)及其抗腫瘤作用機制研究.pdf

1、本研究旨在構建具長循環(huán)、主動靶向、還原和 pH敏感釋藥等功能于一體的聚合物釋藥系統(tǒng)。首先以4代的聚酰胺-胺樹狀大分子（Polyamidoamine dendrimer，PAMAM）為聚合物骨架材料，通過二硫鍵將聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）連接在PAMAM的表面，合成不同PEG化程度的PAMAM-SS-PEG（PSSP）聚合物，然后以阿霉素（Doxorubicin，DOX）為抗腫瘤模型藥物制備了PAMAM-S

2、S-PEG/DOX（PSSP/DOX）復合物。通過考察不同聚合物對載藥系統(tǒng)體內外活性的影響，優(yōu)選出PEG化程度最佳的聚合物PSSP32作進一步研究。為了進一步提高PSSP32聚合物的主動靶向作用，增強其抗腫瘤活性，采用雙功能化的HS-PEG5000-COOH偶聯(lián)cRGDyK多肽和 PAMAM,合成 RGD-PEG-SS-PEG-PAMAM（RGD-PSSP）聚合物，并在此基礎上制備了RGD-PEG-SS-PEG-PAMAM/DOX（RG

3、D-PSSP/DOX）復合物。隨后對復合物的制劑學特性、細胞毒性、細胞攝取、攝取機制以及荷瘤小鼠的體內抗腫瘤活性進行了研究。
　　首先，以4代PAMAM、SPDP和CH3O-PEG5000-HS為起始材料合成了三種不同PEG化程度的PSSP聚合物，分別稱為PSSP8、PSSP16和PSSP32。通過TLC、1H NMR和FTIR對聚合物進行了結構確證，同時測定了三種聚合物的粒徑和Zeta電位值，并在體外考察了聚合物的還原敏感性、溶

4、血毒性及在血清中的穩(wěn)定性。此外，采用熒光顯微鏡和流式細胞術考察RAW264.7巨噬細胞對聚合物的攝取情況，結果表明經過PEG化修飾后的PSSP聚合物能顯著減少被RAW264.7細胞的攝取，有助于延長在血液中的滯留時間，實現(xiàn)對腫瘤的被動靶向作用。最后，以異硫氰酸鹽羅丹明B（RBITC）為熒光探針，通過共聚焦顯微鏡（CLSM）考察了PSSP聚合物在胞內轉運情況，結果表明聚合物進入細胞后主要分布在細胞質和溶酶體中，并能從溶酶體中逃逸出來進入細

5、胞質中，從而在高濃度谷胱甘肽（GSH）的刺激下發(fā)生二硫鍵斷裂，迅速釋放其包載的藥物。
　　其次，以DOX作為抗腫瘤模型藥物，通過疏水作用制備了三種不同PEG化程度的PSSP/DOX復合物，并對其制劑學性質進行了評價。結果表明復合物具有較高的包封率，載藥量在10％左右，載藥前后其粒徑和Zeta電位均未發(fā)生明顯變化。體外釋放結果表明，PSSP/DOX復合物具有明顯的還原和pH敏感性，并且DOX的釋放程度隨著PEG化程度的增加而增加。<

6、br>　　再次，以B16和A549細胞作為腫瘤細胞模型，分別對PSSP/DOX復合物的細胞毒性，細胞攝取及胞內的藥物分布情況進行了考察。結果表明復合物的細胞毒性隨著PEG化程度增加而增加，但細胞攝取卻隨著PEG化程度增加而減少，結合體外釋放、細胞毒性實驗及胞內藥物分布情況，證實了細胞內的藥物釋放是決定細胞毒性的關鍵因素。通過多種內吞抑制劑來考察PSSP/DOX復合物的攝取機理，結果表明復合物是通過網(wǎng)格蛋白介導的內吞途徑和小窩蛋白介導的內

7、吞途徑進入細胞。此外，通過酸性抑制劑氯喹和 GSH抑制劑馬來酸二乙酯（DEM）來進一步考察PSSP/DOX復合物的細胞毒作用，結果表明兩種抑制劑分別能抑制細胞內的酸性環(huán)境和還原環(huán)境，從而導致復合物的細胞毒作用減弱。這也進一步證實了復合物是通過網(wǎng)格蛋白介導的內吞途徑和小窩蛋白介導的內吞途徑進入細胞，從而在細胞內兩種不同的環(huán)境中釋放藥物。以B16荷瘤小鼠為腫瘤動物模型，考察了PSSP/DOX復合物在小鼠體內的抗腫瘤作用，結果表明該復合物能明

8、顯抑制腫瘤的生長，并且能顯著降低DOX對小鼠的毒副作用。
　　最后，采用雙功能化的HS-PEG5000-COOH在PSSP聚合物上偶聯(lián)cRGDyK多肽合成RGD-PSSP聚合物，在此基礎上制備RGD-PSSP/DOX復合物并對其體內外活性進行評價。體外釋放結果表明，RGD-PSSP/DOX復合物的釋放行為具有明顯的還原和pH敏感性，與PSSP/DOX相比，連接上RGD后對釋放無明顯影響。以人臍靜脈內皮細胞HUVEC作為腫瘤新生血管

9、內皮細胞模型，同時以B16細胞作為腫瘤細胞模型，對 RGD-PSSP/DOX復合物的細胞毒性、細胞攝取及攝取機理進行考察。細胞毒性結果顯示連接上RGD后顯著增加了RGD-PSSP/DOX復合物對兩種細胞的細胞毒性。細胞攝取及攝取機理研究表明，RGD-PSSP/DOX主要通過RGD多肽與細胞表面高表達的整合素αvβ3受體特異性的相互識別來與細胞接觸，然后通過網(wǎng)格蛋白介導的內吞和細胞膜穴樣內陷介導的內吞兩種方式被細胞攝取。B16荷瘤小鼠的體