糖皮質(zhì)激素對馬兜鈴酸腎病的臨床及實驗研究.pdf

1、第一部分低劑量糖皮質(zhì)激素對不同程度腎損傷的慢性馬兜鈴酸腎病患者病情進展的影響及可能機制
　　 目的:馬兜鈴酸腎病(Aristolochic acid nephropathy,AAN)是馬兜鈴類中草藥引起的腎小管間質(zhì)疾病。我國AAN以慢性最為多見,其病理損害大多數(shù)表現(xiàn)為腎間質(zhì)纖維化。大量研究表明,各種腎間質(zhì)纖維化均可能有炎癥參與或有免疫因素參與。迄今為止,對慢性AAN尚無成熟的治療方案。近年來,國內(nèi)外已有少量關(guān)于糖皮質(zhì)激素治療慢性

2、AAN的報告,提示糖皮質(zhì)激素對延緩AAN進展有一定療效。本研究應(yīng)用低劑量糖皮質(zhì)激素對伴有輕中度及重度腎功能不全的慢性AAN患者進行治療,重點觀察該治療對慢性AAN的病程有無有益作用。
　　 方法:選擇北京協(xié)和醫(yī)院腎內(nèi)科1998年11月～2010年4月臨床診斷慢性AAN患者共79例進入本研究。根據(jù)治療前血清肌酐水平分為輕中度腎功能不全組(血肌酐＜354μmol/1,42例)和重度腎功能不全組(血肌酐≥354μmol/1,37例)。

3、輕中度腎功能不全組AAN患者分為激素治療組(n=18)與對照組(n=24),兩組患者在性別分布(P=0.839)、年齡(P=0.39)、治療前各項血生化指標(biāo)、血紅蛋白及血壓等方面均無顯著差異。重度腎功能不全組AAN患者分為激素治療組(n=23)與對照組(n=14),兩組在性別分布(P=0.353)、年齡(P=0.262)、治療前各項血生化指標(biāo)、血紅蛋白及血壓等方面均無顯著差異。對輕中度腎功能不全患者隨診觀察2年,重度腎功能不全患者隨診觀

4、察1年。分別對兩組患者的血清肌酐值進行自身前后和組間比較,以評價激素治療對腎功能不全的慢性AAN患者的病程進展有無影響；同時對接受糖皮質(zhì)激素治療的輕中度與重度腎功能不全患者的臨床轉(zhuǎn)歸進行比較分析,以評價不同程度。腎功能不全的AAN患者從激素治療中的獲益有無差別。
　　 結(jié)果輕中度腎功能不全的AAN患者,激素治療組在2年隨訪時間內(nèi)血肌酐基本維持穩(wěn)定,與治療前比較無顯著差異(P＞0.05)；對照組患者在隨診中血肌酐緩慢進行性升高,在

5、9～24月的各時間點與治療前比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。輕中度腎功能不全的AAN患者中激素治療組與對照組兩組間比較,在9～24月的各時間點,激素治療組的血清肌酐均顯著低于對照組(P＜0.05)。
　　 重度腎功能不全的AAN患者,激素治療組血肌酐在6月內(nèi)逐步下降,與初始比較有明顯統(tǒng)計學(xué)差異；9月、12月血肌酐值略有回升,與治療前相比無明顯差異。而對照組患者血肌酐持續(xù)緩慢升高,6月、9月、12月時與初始比較均有明顯統(tǒng)計學(xué)差

6、異。重度腎功能不全的AAN患者中激素治療組與對照組兩組間比較,在6～12月的各時間點,激素治療組的血清肌酐均顯著低于對照組(P＜0.05)。
　　 接受糖皮質(zhì)激素治療的患者,重度腎功能不全組與輕中度腎功能不全組比較,兩組患者在總隨訪時間內(nèi)治療有效率無明顯差異。
　　 所有患者在隨診過程中血生化指標(biāo)、血壓、血紅蛋白等均無明顯變化。激素治療組患者,尿轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor,FGF)

7、-β1和單核細胞趨化蛋白(monocyte chemoattractant protein,MCP)-1明顯下降。治療過程中的不良反應(yīng)輕微,僅部分患者出現(xiàn)類固醇糖尿病和帶狀皰疹病毒感染,2例高齡患者發(fā)生股骨頭壞死。
　　 結(jié)論低劑量糖皮質(zhì)激素能逆轉(zhuǎn)或延緩輕中度及重度腎功能不全的慢性 AAN患者病情進展,該種保護作用在治療后3個月內(nèi)即出現(xiàn),至少可維持1～2年；低劑量糖皮質(zhì)激素安全性較好,多數(shù)患者可耐受；糖皮質(zhì)激素可降低尿 TGF-

8、β1和MCP-1的水平,可能是其治療慢性AAN的作用機制之一。
　　 第二部分馬兜鈴酸腎病合并范可尼綜合征患者臨床及生化特點分析
　　 目的:小劑量馬兜鈴酸(Aristolochic acid,AA)作用于腎小管上皮細胞,可使該細胞變性、萎縮,出現(xiàn)腎小管功能障礙型 AAN,主要表現(xiàn)為腎小管酸中毒和/或Fanconi綜合征(Fanconi syndrome,FS)。目前國內(nèi)外已有少量關(guān)于AAN伴Fanconi綜合征的個案報

9、道,尚未見大宗臨床觀察。目前漏診、誤診仍常有發(fā)生,為了提高臨床醫(yī)生對AAN合并Fanconi綜合征患者的認識,本研究對AAN合并Fanconi綜合征患者的臨床表現(xiàn)及生化特點進行分析。
　　 方法:回顧性分析1998年11月～2010年9月北京協(xié)和醫(yī)院腎內(nèi)科診斷AAN’合并Fanconi綜合征患者38例(初始血肌酐≤354μmol/l),男性10例,女性28例,平均年齡為55.81±14.14歲。根據(jù)是否應(yīng)用激素治療分為一般治療組

10、(n=10)和激素治療組(n=28)。對所有患者隨診觀察1年,主要觀察患者的臨床表現(xiàn)、血生化指標(biāo)、血氣分析指標(biāo)、尿糖、尿氨基酸定性、尿β2微球蛋白(β2-microglobulin,β2-MG)等指標(biāo)以及治療反應(yīng)。
　　 結(jié)果:患者臨床癥狀以乏力(68.42％)、惡心納差(42.11％)、夜尿增多(15.79％)和腰背痛(21.05％)為主要表現(xiàn),部分患者有明顯多飲多尿(26.32％),表現(xiàn)為骨痛、手足抽搐及泌尿系感染者均占5.

11、26％。
　　 所有患者均有明顯高氯性代謝性酸中毒,3例患者行碳酸氫根重吸收排泄試驗給予了證實?；颊哂忻黠@物質(zhì)轉(zhuǎn)運障礙,包括低磷血癥17例(44.74％)、低尿酸血癥12例(31.58％)、腎性糖尿(100％)、氨基酸尿(72.2％)和低分子量蛋白尿(24小時尿蛋白1.06±0.58g),尿β2-MG明顯升高(2855.12±3488.98ng/l)。4例患者接受腎活檢,結(jié)果顯示有明顯小管-間質(zhì)病變。
　　 隨訪過程中,

12、對照組患者大多數(shù)進入透析,尿糖持續(xù)存在。糖皮質(zhì)激素治療組大多數(shù)患者腎功能維持穩(wěn)定,尿氨基酸轉(zhuǎn)陰,部分患者尿糖消失。所有患者12月時尿β2-MG明顯降低(879.08±694.19ng/l),血尿酸、血磷有所恢復(fù),分別為273.30±81.27μmol/l和1.15±0.23 mmol/l,和初始相比均有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:馬兜鈴酸腎病可合并Fanconi綜合征,完善相關(guān)檢查可明確診斷；糖皮質(zhì)激素對AAN

13、繼發(fā)的范可尼綜合征有一定療效。
　　 第三部分地塞米松對馬兜鈴酸誘導(dǎo)HKC細胞上皮.間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的作用
　　 目的:腎小管上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)在腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。馬兜鈴酸可誘導(dǎo)腎小管上皮細胞發(fā)生EMI’轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細胞,還可能通過細胞間“交叉對話”(如釋放細胞因子等)作用于間質(zhì)成纖維細胞,激活后者合成及分泌大量細胞外基

14、質(zhì),致使腎間質(zhì)纖維化。近年來,有報道應(yīng)用糖皮質(zhì)激素治療馬兜鈴酸腎病,但其機制尚不十分清楚。
　　 本部分的研究目的是探討地塞米松(Dexamethasone,Dex)對AA誘導(dǎo)人腎小管上皮細胞(HKC)發(fā)生EMT的作用。
　　 方法:實驗一實驗分組為:(1)正常對照組；(2)AA刺激組(10μg/ml)；(3)地塞米松作用組(100μmol/l)；(4)AA(10μg/ml)+無水乙醇(100μmol/l)組；(5)AA

15、(10μg/ml)+不同劑量的地塞米松(100、10、1、0.1、0.01μmol/1)共同處理48小時。應(yīng)用激光共聚焦方法檢測HKC細胞α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscleactin,α-SMA)、E-鈣粘素(E-cadherin)的表達,Real-time PCR、Western Blot方法檢測α-SMA、E-鈣粘素的表達強度,ELISA法檢測培養(yǎng)上清液中纖維連接蛋白(fibronectin,FN)、Ⅰ型膠原(col

16、lagenⅠ,COLⅠ)的表達。
　　 實驗二實驗分組為:(1)正常對照組；(2)AA刺激組(10μg/ml)；(3)地塞米松作用組(100μmol/l)；(4)AA(10μg/ml)+地塞米松(100μmol/l)共同處理0、6、12、24、48小時。Real-time PCR、Western Blot方法檢測α-SMA、E-鈣粘素的表達強度,ELISA法檢測培養(yǎng)上清液中FN、COLⅠ的表達。所有實驗均重復(fù)3次。
　　

17、 結(jié)果:
　　 1.激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),作用48小時,與陰性對照組比較,AA作用組和AA+無水乙醇組E-鈣粘素表達明顯減弱,α-SMA表達明顯增強,單獨Dex作用組與陰性對照組相比無明顯變化。同AA作用組相比,Dex(100μmol/l)與AA共同作用組,α-SMA表達明顯減弱而E-鈣粘素表達明顯增加。隨Dex濃度下降,α-SMA表達逐漸增加而E-鈣粘素表達逐漸減弱。
　　 2.Real—time PCR、West

18、ern Blot和ELISA結(jié)果顯示,AA作用48小時后,HKC細胞α-SMA表達較陰性對照組顯著升高,E-鈣粘素表達顯著降低,培養(yǎng)液上清中FN、COLⅠ明顯升高(P＜0.05),而單獨Dex作用組和陰性對照組相比無明顯變化。與AA單獨作用組相比,Dex(100μmol/l)與AA共同作用組α-SMA表達明顯降低,E-鈣粘素表達顯著升高,隨著與AA共同作用的Dex濃度下降,α-SMA表達和培養(yǎng)液上清中FN、COLⅠI的水平逐漸升高,E-

19、鈣粘素表達逐漸降低(P＜0.05)。
　　 3.Real-time PCR、Western Blot和ELISA結(jié)果顯示,48小時內(nèi),隨作用時間延長,AA組α-SMA和培養(yǎng)液上清中FN、COLⅠ的水平逐漸增加,E-鈣粘素表達逐漸減低,與對照組相比,在24和48小時有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。AA+Dex組α-SMA和培養(yǎng)液上清中FN、COLⅠ的水平在48小時內(nèi)逐漸下降,而E-鈣粘素的表達在48小時內(nèi)無明顯降低,和單獨AA刺

20、激組相比,48小時有明顯差異(P＜0.05)。
　　 結(jié)論 AA能誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的HKC細胞發(fā)生EMT,Dex能呈濃度依賴性地抑制 AA誘導(dǎo)HKC細胞發(fā)生EMT,主要發(fā)生于Dex干預(yù)后24和48小時。
　　 第四部分地塞米松抑制馬兜鈴酸誘導(dǎo)HKC細胞EMT過程中Smad信號途徑表達的變化
　　 目的:有研究表明,在慢性馬兜鈴酸刺激導(dǎo)致的EMT和間質(zhì)纖維化過程中,TGF-β1/Smad信號途徑起主要作用；該途徑中起關(guān)

21、鍵作用的是Smad3,在Smad3基因敲除的實驗動物中,腎組織無明顯EMT發(fā)生。近年來,已有少量關(guān)于糖皮質(zhì)激素治療慢性AAN的報告,研究發(fā)現(xiàn)激素治療對AAN模型大鼠的腎間質(zhì)纖維化有一定程度的減輕。同時相關(guān)學(xué)科領(lǐng)域研究發(fā)現(xiàn),在支氣管上皮細胞發(fā)生EMT過程中,給予地塞米松可減少α-SMA、Ⅰ型膠原和粘蛋白C的表達；在成骨細胞中,應(yīng)用地塞米松可抑制Smad3途徑的激活。本部分的研究目的是探討Dex抑NAA誘導(dǎo)HKC細胞發(fā)生EMT的過程中對TG

22、F-β1/Smad信號途徑的影響。
　　 方法:實驗一實驗分組為:(1)正常對照組；(2)AA刺激組(10μg/ml)(3)地塞米松作用組(100μmol/l)(4)AA(10μg/ml)+無水乙醇(100μmol/l)組；(5)AA(10μg/ml)+不同劑量的地塞米松(100、10、1、0.1、0.01μmol/l)共同處理48小時。實時熒光定量PCR方法檢測HKC細胞的Smad7和TGF-β1 mRNA的表達,Wester

23、n Blot方法檢測HKC細胞的TGF-β1、p-Smad3、Smad3和Smad7蛋白的表達。
　　 實驗二實驗分組為:(1)正常對照組；(2)AA刺激組(10μg/ml)(3)地塞米松作用組(100μmol/l)(4)AA(10gg/ml)+地塞米松(100μmol/l)共同處理0、6、12、24、48小時。實時熒光定量PCR方法檢測HKC細胞的Smad7和TGF-β1 mRNA的表達,Western Blot方法檢測HKC

24、細胞的TGF-β1、p-Smad3、Smad3和Smad7蛋白的表達。
　　 結(jié)果:
　　 1.和陰性對照組相比,AA刺激組HKC細胞TGF-β1 mRNA表達、p-Smad3和TGF-β1蛋白表達水平均顯著增高,Smad7 mRNA和蛋白表達水平顯著下降；Dex單獨作用組以上各指標(biāo)均無明顯變化。而AA+Dex組,不同濃度Dex干預(yù)后HKC細胞TGF-β1 mRNA、p-Smad3和TGF-β1蛋白表達水平呈下降趨勢,S

25、mad7 mRNA和蛋白表達水平均逐漸升高,其中較高濃度的Dex處理組最顯著。
　　 2.48小時內(nèi),隨作用時間延長,AA刺激組TGF-β1 mRNA、p-Smad3和TGF-β1的蛋白表達水平均逐漸增加,Smad7 mRNA和蛋白表達逐漸下降,以24和48小時最明顯,和陰性對照組相比均有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。而AA+Dex組TGF-β1mRNA和蛋白表達、p-Smad3蛋白表達在48小時內(nèi)均無明顯升高,Smad7 m