伊洛前列素對2型固有淋巴細胞的作用研究.pdf

1、背景與目的:
　　過敏性哮喘是一種以肺部炎癥、氣道高反應性、粘液分泌過多和氣道重塑為特征的復雜的呼吸道異質性疾病。在過敏性哮喘中，ILC2s在2型免疫反應的起始和進展階段起到了十分關鍵的促進作用。當呼吸道受到抗原、寄生蟲或病毒的刺激之后，受損的氣道上皮細胞可以分泌IL-33、IL-25以及TSLP等“警報素”，這些細胞因子能夠激活ILC2s產(chǎn)生IL-5、IL-13、IL-9等Th2型細胞因子，促使肺部嗜酸性粒細胞的浸潤，氣道黏液的

2、分泌和氣道平滑肌收縮。此外，ILC2s可以協(xié)調細胞反應網(wǎng)絡，與多種類型的免疫細胞進行交互作用，促使肺損傷炎癥反應和組織修復。
　　Friedrich C.Luft等人通過動物研究發(fā)現(xiàn)，具有血栓素抑制特性的COX產(chǎn)物可以改善哮喘模型小鼠的哮喘癥狀，即COX產(chǎn)物能夠抑制過敏原誘導的過敏性炎癥反應;PGI2是花生四烯酸經(jīng)COX途徑的代謝產(chǎn)物，在肺部的來源主要是是血管內皮細胞，可通過G蛋白偶聯(lián)受體IP發(fā)揮生物學效應。PGI2類似物伊洛前列

3、素在臨床一直被應用于治療肺動脈高壓;伊洛前列素作為COX產(chǎn)物類似物的一種，它是否可以擴展應用于過敏性氣道炎癥疾病的治療？直到目前還未被認證。本課題組通過預實驗發(fā)現(xiàn)伊洛前列素可以明顯減輕由IL-33誘導的氣道炎癥模型小鼠的肺部炎癥情況:如小氣道及血管周圍炎細胞浸潤減輕，氣道黏膜上皮杯狀細胞增生及黏液分泌減少，肺組織、BALF中嗜酸性粒細胞和ILC2s含量減少等炎癥減輕現(xiàn)象。初步證實了伊洛前列素能夠明顯改善肺部炎癥情況。
　　ILC2

4、s與Th2型細胞具有相似功能，在氣道炎癥發(fā)生的早期階段可受到“警報素”刺激，分泌大量Th2型細胞因子，被稱作Th2的“鏡像細胞”，是過敏性氣道炎癥早期Th2型細胞因子的主要來源。由于課題組前期已經(jīng)在小鼠氣道炎癥模型中驗證了伊洛前列素可以改善肺部及氣道炎癥情況，但還未有研究證實伊洛前列素可以抑制ILC2s的增殖及功能活化，根據(jù)預實驗結果及查閱相關文獻我們推測伊洛前列素可以通過G蛋白偶聯(lián)受體IP，對ILC2s的功能也產(chǎn)生抑制作用，從而在炎癥

5、發(fā)生的早期發(fā)揮抑制炎癥的作用。為了從細胞水平及分子水平驗證研究設想，本研究擬選用退役（半年以上）C57BL/6J小鼠肺組織中分離出的ILC2s，在體外探究伊洛前列素對ILC2s的增殖及其分泌IL-5、IL-13的能力的影響，為哮喘的治療提供新的治療依據(jù)。
　　方法:
　　1.體內預實驗:選用6-8周雌性C57BL/6J小鼠，隨機分為vehicle組、IL-33刺激組、IL-33+iloprost干預組、伊洛前列素對照組，采用

6、IL-33滴鼻法建立小鼠氣道炎癥模型，HE染色觀察肺組織中小氣道及血管周圍炎癥浸潤情況;PAS染色檢測氣道上皮杯狀細胞增生及黏液分泌情況。
　　2.體外實驗:選取C57BL/6J退役雌鼠，密度梯度離心法結合磁珠分選法分離出肺組織中的Lineage淋巴細胞，流式細胞術分選出lineage-KLRG-1+Sca-1+細胞，即ILC2s。將分選得到的ILC2s分為vehicle、IL-33、IL-33+伊洛前列素和單獨伊洛前列素組。細胞

7、計數(shù)檢測不同組細胞數(shù);IC檢測ILC2s內Ki-67、GATA3、STAT5表達情況;
　　3.分子實驗:ELISA檢測細胞培養(yǎng)72h后上清中IL-5、IL-13水平;實時熒光定量PCR檢測ILC2s中IL-5、IL-13、GATA3、PPARγ的mRNA相對表達量。
　　結果:
　　一、體內預實驗結果
　　1.HE和PAS染色結果經(jīng)鼻滴入IL-33后，IL-33刺激組小鼠肺組織切片可見大量炎性細胞浸潤、杯狀細胞

8、增生以及黏液分泌增加;使用伊洛前列素干預后小氣道及血管周圍炎細胞浸潤明顯減少，氣道上皮杯狀細胞增生情況減輕，黏液分泌減少。
　　二、體外實驗結果
　　1.細胞計數(shù)結果對培養(yǎng)72h的ILC2s進行分組計數(shù)，結果發(fā)現(xiàn)IL-33刺激組（11170.41±2210.20個/孔）較vehicle（8334.46±2020.11個/孔）、單獨伊洛前列素組（6972.57±850.13個/孔）細胞數(shù)明顯增多(P＜0.05)，IL-33+伊

9、洛前列素干預組（6972.57±850.13個/孔）細胞數(shù)目則較IL-33組明顯減少(P＜0.05)。
　　2.IC結果對分組培養(yǎng)24h的ILC2s細胞進行胞內染色，檢測核內磷酸化蛋白pSTAT5水平，結果發(fā)現(xiàn)IL-33組pSTAT5水平（MFI:4706.91±1343.11）明顯較vehicle組（MFI:2051.63±794.10）、單獨伊洛前列素組（MFI:2429.37±635.00）明顯升高，而IL-33+伊洛前列素

10、組pSTAT5水平(MFI:2706.01±579.29)較IL-33組明顯降低（P＜0.05）;對培養(yǎng)72h的ILC2s進行胞內染色檢測轉錄因子GATA3表達量，研究結果趨勢與pSTAT5檢測結果趨勢相同;IL-33組GATA3水平(MFI:22120.60±5740.00)較vehicle組（MFI:14680.34±5631.11）、單獨伊洛前列素組（MFI:11503±3251.41）明顯升高(P＜0.05);而IL-33+伊洛

11、前列素組GATA3水平（MFI:10340.18±3293.21）較IL-33組明顯降低（P＜0.05）;胞內染色檢測分組培養(yǎng)72h后ILC2s核內Ki-67表達情況，結果顯示:IL-33組Ki-67+ILC2s百分比（68.28±9.45％）較vehicle組（54.48±7.43％）、單獨伊洛前列素組(50.36±5.83％)明顯升高（P＜0.05）;而IL-33+伊洛前列素組Ki-67+ILC2s百分比(46.22±15.81％)

12、較IL-33組明顯降低（P＜0.05）。
　　三、分子實驗結果
　　1.ELISA結果ELISA檢測72h時細胞培養(yǎng)上清，結果發(fā)現(xiàn)IL-33組細胞培養(yǎng)上清中IL-5及IL-13水平（IL-5:397.00±53.57pg/mL，IL-13:284.85±36.92pg/mL）較vehicle組（IL-5:21.43±3.64pg/mL，IL-13:20.25±2.19pg/mL）、單獨伊洛前列素組（IL-5:23.05±4.

13、09pg/mL，IL-13:20.70±4.46pg/mL）有明顯升高(P＜0.05)，而IL-33+伊洛前列素組細胞培養(yǎng)上清中IL-5及IL-13水平（IL-5:277.48±27.94,IL-13:19.90±3.44）較IL-33組明顯降低(P＜0.05)。
　　2.Real-time PCR結果IL-33刺激組ILC2s中IL-5（1.69±0.46）、IL-13(1.90±0.56)、GATA3（0.78±0.36）相對

14、表達量較vehicle組(1)和單獨伊洛組（IL-5:0.39±0.20，IL-13:0.18±0.12，GATA3:0.24±0.09）明顯上調（P＜0.05）;IL-33聯(lián)合伊洛前列素組中IL-5（0.71±0.39）、IL-13（1.01±0.71）、GATA3（0.11±0.08）mRNA相對表達量明顯下降(P＜0.05);IL-33+伊洛前列素組（4.20±0.4）、單獨伊洛前列素組（1.89±0.38）PPAR gamma相