睡眠呼吸暫停模式間歇低氧對大鼠淋巴細胞及淋巴細胞與血管內(nèi)皮細胞相互作用的研究.pdf

1、研究目的與背景:
　　阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(OSAS)是指在睡眠期反復(fù)發(fā)生上氣道阻塞并引起呼吸暫停的一種常見病。該病睡眠時反復(fù)出現(xiàn)呼吸暫停，伴隨不同程度的間歇低氧(IH)。OSAS是一種全身系統(tǒng)性疾病，炎癥和氧化應(yīng)激是其主要特征，對心血管系統(tǒng)的損害已得到國內(nèi)外呼吸和心血管領(lǐng)域的普遍認可和關(guān)注。白細胞與內(nèi)皮細胞黏附可導(dǎo)致內(nèi)皮細胞損傷，在內(nèi)皮功能障礙導(dǎo)致的心血管合并癥中發(fā)揮重要作用。目前認為OSAS模式IH激活的中性粒細胞及中性粒

2、細胞與血管內(nèi)皮細胞的相互作用可引起一系列炎癥介質(zhì)的變化，但迄今IH對淋巴細胞作用研究甚少，淋巴細胞與內(nèi)皮細胞的黏附及相互作用導(dǎo)致內(nèi)皮損傷等機制尚不清楚。研究表明在OSAS中，IH能夠激活單核細胞，進而促使黏附分子和ROS的產(chǎn)生，且單核細胞對內(nèi)皮細胞的黏附活性顯著增強，提示在OSAS損傷內(nèi)皮細胞機制中單核細胞具有重要的功能?；谝陨辖Y(jié)果我們假設(shè)IH誘導(dǎo)大鼠循環(huán)血中淋巴細胞的激活，激活的淋巴細胞與內(nèi)皮細胞黏附增加，并進一步激活內(nèi)皮細胞，釋放

3、促炎細胞因子TNF-α、IL-8、CRP和ICAM-1等，同時氧化及抗氧化狀態(tài)失衡，炎性介質(zhì)以接觸依賴的方式誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞的損傷，多種轉(zhuǎn)錄因子參與內(nèi)皮細胞損傷及凋亡。為此，本研究模擬OSAS建立IH大鼠模型，觀察IH模型大鼠淋巴細胞及亞型的凋亡，檢測淋巴細胞與內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)炎性因子及氧化應(yīng)激的水平，同時檢測參與內(nèi)皮細胞凋亡及通路的信號蛋白，最后探討抗氧化劑干預(yù)效果，為臨床OSAS合并癥的發(fā)病機制提供理論依據(jù)。
　　內(nèi)容：
　　

4、1. IH暴露下大鼠淋巴細胞亞群凋亡狀態(tài)及抗氧化劑Tempol干預(yù)研究
　　2. IH暴露下大鼠淋巴細胞與血管內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)后炎癥及氧化應(yīng)激程度，及內(nèi)皮細胞凋亡機制的研究。
　　方法：
　　1.將56只雄性Wistar大鼠隨機分為①常氧對照組(NC);②IH4周組(IH4);③IH6周組(IH6);④早期抗氧化干預(yù)(IH6T)組;⑤早期生理鹽水干預(yù)(IH6N);⑥晚期抗氧化干預(yù)組(IH6T2);⑦晚期生理鹽水干預(yù)(IH

5、6N2)。每組8只，IH暴露環(huán)境最低氧濃度均為5％，AHI30/h。應(yīng)用Tempol從暴露開始時及暴露4周后分別進行早期(IH6T組)和晚期(IH6T2組)干預(yù)，予生理鹽水干預(yù)作對照。暴露結(jié)束后，各組大鼠均麻醉后腹主動脈取血，分離純化淋巴細胞，無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中重懸，用抗體標記淋巴細胞亞群，流式檢測凋亡。
　　2.使用正常大鼠主動脈內(nèi)皮細胞，細胞分為常氧對照組及IH組(IH暴露5 h)，淋巴細胞選用大鼠IH6周組(I

6、H6)、早期干預(yù)(IH6T)及常氧對照組(NC)，直接接種于已含內(nèi)皮細胞的孔板中，共培養(yǎng)分為6組：①常氧大鼠淋巴細胞與常氧內(nèi)皮組(NC+NE)；②常氧大鼠淋巴細胞與IH內(nèi)皮組(NC+IHE)；③ IH6周大鼠淋巴細胞與常氧內(nèi)皮組(IH6+NE)；④ IH6周大鼠淋巴細胞與IH內(nèi)皮組(IH6+IHE)；⑤抗氧化干預(yù)大鼠淋巴細胞與常氧內(nèi)皮(IH6T+NE)；⑥抗氧化干預(yù)大鼠淋巴細胞與IH內(nèi)皮組(IH6T+IHE)。將共培養(yǎng)板置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)

7、共培養(yǎng)4 h，取上清液離心后分裝待檢測，內(nèi)皮細胞提取蛋白及mRNA。
　　3.采用ELISA法檢測各上清液CRP、TNF-α、IL-8、ICAM-1、MDA、CAT及SOD的水平，用蛋白印跡法檢測內(nèi)皮細胞內(nèi)Caspase3、NF-κB P65、Bcl-2及Bax蛋白的表達。Real-time PCR法檢測內(nèi)皮細胞內(nèi)NADPH P22、C-FOS、HIF-1α以及MAPK P38 mRNA表達水平。
　　結(jié)果：
　　第一

8、部分：
　　IH6組、IH4組與NC組比較，IH6組與IH4組比較，CD4、CD8淋巴細胞凋亡減少，B、NK淋巴細胞凋亡增多。IH6T、IH6T2組與IH6比較，IH6T與IH6T2比較，CD4、CD8淋巴細胞凋亡增加，B、NK淋巴細胞凋亡減少。IH6T、IH6T2組與NC比較，CD4、CD8淋巴細胞凋亡減少，B、NK淋巴細胞凋亡增多，F(xiàn)值分別為：15.57(CD4)；24.79(CD8)；18.158(B)；21.94(NK)。

9、
　　第二部分結(jié)果：
　　1.淋巴細胞與內(nèi)皮共培養(yǎng)后，IH6+IHE、H6+NE組與NC+NE組，IH6+IHE分別與IH6+NE、NC+IHE相比，NC+IHE組與NC+NE組相比，共培養(yǎng)液CRP、TNF-α、IL-8、ICAM-1及MDA的水平明顯升高，但SOD和CAT明顯下降；IH6T+NE與IH6+NE組，IH6T+IHE與IH6+IHE比較，TNF-α、IL-8、ICAM-1、CRP及 MDA的水平明顯下降，但 S

10、OD和CAT明顯上升；但 IH6T+NE組與NC+NE組，IH6T+IH組 E與NC+IHE組比較，TNF-α、IL-8、ICAM-1、CRP及MDA的水平仍明顯升高，但SOD和CAT明顯下降；F值分別為26.30(TNF-α)、14.048(IL-8)、26.96(ICAM-1)、17.477(CRP)、76.75(MDA)、18.76(SOD)及28.30(CAT)。
　　2.淋巴細胞與內(nèi)皮共培養(yǎng)后，IH6+IHE組、H6+N

11、E組與NC+NE組，IH6+IHE組分別與IH6+NE組、NC+IHE相比，NC+IHE組與NC+NE組相比，內(nèi)皮細胞表達 NF-κB P65、Caspase-3、Bax蛋白增加，BCL-2蛋白表達減少；IH6T+NE組與IH6+NE組，IH6T+IHE組與IH6+IHE比較，內(nèi)皮細胞表達NF-κB P65、Caspase-3、Bax蛋白減少，BCL-2蛋白表達增加；但IH6T+NE組與NC+NE組，IH6T+IHE組與NC+IHE比較

12、，內(nèi)皮細胞表達NF-κB P65、Caspase-3、Bax仍蛋白增加，BCL-2蛋白表達減少；F值分別為82.65(NF-κB P65)、37.68(Caspase-3)、41.009(Bax)、51.72(BCL-2)、60.681(BCL-2/Bax)。
　　3.淋巴細胞與內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)后，IH6+IHE組、H6+NE組與NC+NE組，IH6+IHE組分別與IH6+NE組、NC+IHE組相比，NC+IHE組與NC+NE組相比

13、較，內(nèi)皮細胞表達NADP P22 mRNA、C-FOS mRNA、HIF-1α、MAPK P38 mRNA增多；IH6T+NE組與IH6+NE組，IH6T+IEH組與IH6+IHE組比較，內(nèi)皮細胞表達NADPH P22、C-FOS、HIF-1α和MAPK P38 mRNA減少；但IH6T+NE組與NC+NE組，IH6T+IHE組與NC+IHE組比較，內(nèi)皮細胞表達 NADP P22 mRNA、C-FOS mRNA、HIF-1α、MAPK

14、P38 mRNA仍增多；F值分別為27.64(NADPH P22)、72.772(C-FOS)、30.04(HIF-1α)、43.84(MAPK P38)。
　　結(jié)論：
　　1. IH暴露大鼠體內(nèi)的淋巴細胞凋亡狀態(tài)被改變，并可導(dǎo)致免疫失衡，抗氧化劑干預(yù)能夠改善IH的損傷作用。
　　2. IH暴露大鼠淋巴細胞與血管內(nèi)皮細胞相互作用，導(dǎo)致氧化/抗氧化失衡，血管內(nèi)皮細胞釋放炎癥因子及細胞損傷與凋亡增加。IH暴露淋巴細胞誘導(dǎo)血