轉(zhuǎn)錄因子c-Jun-AP-1對(duì)α1,2-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)的調(diào)控.pdf

1、卵巢癌是婦科三大惡性腫瘤之一，死亡率居首位。多年來(lái)卵巢癌5年生存率一直徘徊在30％以下，如果卵巢癌能夠早期發(fā)現(xiàn)并治療，其5年生存率可以提高到70～90％。因此，為尋求有效的早期診斷和治療方案，卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制一直是婦科腫瘤基礎(chǔ)與臨床研究探索的重點(diǎn)。
　　糖復(fù)合物是細(xì)胞膜的重要組成部分，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、分子粘附等分子相互作用，與細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、運(yùn)動(dòng)、分化等重要生命過(guò)程密切相關(guān)。腫瘤細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)異常的糖鏈可被機(jī)體的免疫系統(tǒng)視為非己

2、外來(lái)物，成為腫瘤相關(guān)糖抗原(TACA)，可以作為腫瘤標(biāo)記分子，對(duì)腫瘤的診斷、預(yù)后判斷及治療后隨診有重要意義。Lewisy抗原也是一種TACA。Lewisy是含有雙巖藻糖基的寡糖鏈，在惡性上皮性腫瘤中表達(dá)增高，且與預(yù)后相關(guān)，具有重要的臨床意義，可能成為新的腫瘤標(biāo)記分子，但Lewisy增高的上游調(diào)節(jié)機(jī)制至今尚不清楚。
　　α1，2-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶(α1，2-fucosyltransferase，α1，2-FT)是Lewisy抗原合成的關(guān)

3、鍵限速酶，其表達(dá)在α1，2-FT基因轉(zhuǎn)錄水平受到調(diào)控。Iwamori等發(fā)現(xiàn)卵巢癌細(xì)胞系KFr13TX對(duì)紫杉醇產(chǎn)生耐藥性時(shí)，α1，2-FT基因及Lewisy抗原表達(dá)都明顯增高。我們前期對(duì)Lewisy抗原與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移及耐藥的相關(guān)性及機(jī)制進(jìn)行了較為深入的研究。我們將人α1，2-FT基因轉(zhuǎn)染入人卵巢癌細(xì)胞系RMG-I，首次建立了α1，2-FT基因及Lewisy抗原穩(wěn)定高表達(dá)卵巢癌細(xì)胞模型RMG-I-H。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖加快，對(duì)

4、纖連蛋白FN的黏附力增強(qiáng)，且對(duì)5-FU，卡鉑，紫杉醇等的耐藥性增加。裸鼠體內(nèi)致瘤性實(shí)驗(yàn)證明:α1，2-FT基因及Lewisy抗原高表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞克隆成瘤的時(shí)間較對(duì)照組縮短，移植瘤生長(zhǎng)速度較快。siRNA干擾可以改變上述變化。Labarriere等研究證明將α1，2-FT基因反義鏈轉(zhuǎn)入小鼠高侵襲性結(jié)腸癌PROb細(xì)胞后，細(xì)胞在體內(nèi)的致瘤性顯著下降。表明作為產(chǎn)物的Lewisy影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，其表達(dá)在α1，2-FT基因轉(zhuǎn)錄水平受到調(diào)

5、控，但具體調(diào)節(jié)機(jī)制不明確。
　　AP-1是經(jīng)典的細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，受多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)，主要由Jun、Fos兩亞家族單位構(gòu)成，亞家族單位以同源或異源二聚體的形式結(jié)合于DNA靶序列，調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄，參與增殖、惡性轉(zhuǎn)化及凋亡等細(xì)胞病理生理功能調(diào)控。Mishra等研究AP-1與口腔癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，AP-1家族成員無(wú)論是蛋白還是基因水平，在口腔癌組織中的表達(dá)都明顯高于癌前組織和正常組織，表明AP-1在腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和侵襲中發(fā)

6、揮重要作用。我們?cè)谇捌诠ぷ髦袑?duì)三組惡性程度不同的卵巢癌細(xì)胞系進(jìn)行全基因組篩查時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著卵巢癌細(xì)胞系惡性程度的增加，細(xì)胞中α1，2-FT基因及Lewisy抗原的表達(dá)水平也都顯著增高，并且，三種惡性程度高的卵巢癌細(xì)胞系都有c-Jun基因表達(dá)的異常增高，因此我們推測(cè)細(xì)胞癌變時(shí)可能會(huì)通過(guò)上調(diào)AP-1水平，引起α1，2-FT基因轉(zhuǎn)錄活性增高，進(jìn)而上調(diào)α1，2-FT蛋白表達(dá)，最終導(dǎo)致Lewisy表達(dá)增加。
　　綜上，本實(shí)驗(yàn)在前期工作的基礎(chǔ)上

7、，通過(guò)多種生物化學(xué)、免疫學(xué)及分子生物學(xué)研究方法，檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞及卵巢腫瘤組織中AP-1、α1，2-FT及Lewisy抗原的表達(dá)，證明惡性度高的卵巢癌細(xì)胞及組織中AP-1、α1，2-FT及Lewisy抗原表達(dá)均增高，分析α1，2-FT基因啟動(dòng)子活性并鑒定其中的AP-1反應(yīng)元件，α1，2-FT基因的表達(dá)受AP-1轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)，并介導(dǎo)AP-1促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖等功能。為進(jìn)一步研究α1，2-FT/Lewisy的上游調(diào)節(jié)機(jī)制提供新的線索，為卵巢

8、癌的分子診斷和治療提供新的理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　第一部分:免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)兩組惡性程度不同的卵巢癌細(xì)胞中c-Jun的表達(dá);real time PCR方法檢測(cè)卵巢癌組織及正常卵巢組織中c-Jun及α1,2-FTmRNA的表達(dá);免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)卵巢癌組織、交界性卵巢上皮性腫瘤、良性卵巢上皮性腫瘤及正常卵巢組織中c-Jun的表達(dá)。
　　第二部分:以基因組DNA為模板擴(kuò)增α1，2-FT基因啟動(dòng)子序列，構(gòu)建螢光

9、素酶報(bào)告基因載體;雙螢光素酶報(bào)告基因法檢測(cè)α1，2-FT基因啟動(dòng)子活性;雙螢光素酶報(bào)告基因法檢測(cè)c-Jun/AP-1對(duì)α1，2-FT基因啟動(dòng)子活性的影響;PCR法定點(diǎn)突變?chǔ)?，2-FT基因啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)的AP-1結(jié)合位點(diǎn)，雙螢光素酶報(bào)告基因法檢測(cè)突變型α1，2-FT基因啟動(dòng)子活性;EMSA法鑒定α1，2-FT基因啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)的AP-1反應(yīng)元件;ChIP方法鑒定c-Jun/AP-1與α1，2-FT基因啟動(dòng)子結(jié)合;real time RT-P

10、CR及Western blot方法檢測(cè)c-Jun轉(zhuǎn)染前后α1，2-FT mRNA及Lewisy的表達(dá);Westernblot方法檢測(cè)FUT1 siRNA處理后c-Jun對(duì)卵巢癌細(xì)胞Lewisy表達(dá)的影響。
　　第三部分:c-Jun表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞:流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期;CCK8法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況;克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)克隆形成率;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;Transwell法細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力。
　　結(jié)果

11、:
　　第一部分:免疫細(xì)胞化學(xué)方法顯示耐藥和高轉(zhuǎn)移卵巢癌細(xì)胞株中c-Jun表達(dá)增高;real time PCR方法顯示卵巢癌組織中c-Jun及α1，2-FT mRNA的表達(dá)高于正常卵巢組織，且二者在卵巢癌組織中的表達(dá)呈顯著正相關(guān);免疫組織化學(xué)染色法顯示c-Jun在卵巢癌和交界性卵巢上皮性腫瘤組織中的表達(dá)顯著高于良性卵巢上皮性腫瘤和正常卵巢組織，且c-Jun在卵巢癌組織中的表達(dá)與Lewisy呈顯著正相關(guān)。進(jìn)一步分析c-Jun在卵巢癌

12、中的表達(dá)與病理類型、組織分化、手術(shù)病理分期及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)關(guān)。
　　第二部分:構(gòu)建α1，2-FT啟動(dòng)子螢光素酶報(bào)告基因載體，螢光素酶法驗(yàn)證其具有轉(zhuǎn)錄活性;共轉(zhuǎn)染c-Jun可以顯著增加野生型α1，2-FT啟動(dòng)子的螢光素酶活性，定點(diǎn)突變后的突變型α1，2-FT啟動(dòng)子的螢光素酶活性顯著下降;EMSA法驗(yàn)證了包含有AP-1結(jié)合位點(diǎn)的特異性探針能夠與卵巢癌細(xì)胞核蛋白形成復(fù)合物;ChIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了c-Jun/AP-1能夠特異性結(jié)合于包含A

13、P-1結(jié)合位點(diǎn)的α1，2-FT啟動(dòng)子區(qū)域;real time RT-PCR及Westem blot方法檢測(cè)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染c-Jun后，α1，2-FT mRNA及Lewisy表達(dá)增加;FUT1 siRNA處理后再轉(zhuǎn)染c-Jun，卵巢癌細(xì)胞Lewisy表達(dá)的增加顯著下降。
　　第三部分:相對(duì)于對(duì)照組，轉(zhuǎn)染c-Jun的卵巢癌細(xì)胞:流式細(xì)胞儀分析顯示合成前期G1和靜息期G0的百分比顯著下降，而合成期S、合成后期G2及分裂期M的百分比明顯增高;C

14、CK8法顯示細(xì)胞增殖加快，克隆形成率顯著增加;流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率沒(méi)有明顯差異;Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞侵襲能力顯著增強(qiáng)。
　　結(jié)論:
　　第一部分c-Jun/AP-1在惡性程度高的卵巢癌細(xì)胞中表達(dá)增高，在卵巢癌組織中表達(dá)也顯著增高，且與α1，2-FT mRNA及Lewisy表達(dá)顯著正相關(guān)。
　　第二部分α1，2-FT啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)存在AP-1反應(yīng)元件，c-Jun/AP-1能夠特異性結(jié)合于α1，2-FT