人β-1，2-N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶Ⅰ在畢赤酵母中的克隆表達(dá)與活性檢測(cè).pdf

1、畢赤酵母是現(xiàn)在廣泛應(yīng)用的、重要的外源基因表達(dá)宿主。本研究是本室畢赤酵母工程菌糖基化改造系列工作的必要組成部分。β-1,2-N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶I(beta-1,2-N-acetylglucosaminyltransferaseI，GnTI)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞糖蛋白N-糖鏈加工的關(guān)鍵酶之一，催化糖鏈由甘露糖型向雜合型轉(zhuǎn)變。本研究將人的gnt1基因引入畢赤酵母宿主細(xì)胞，以期獲得GnTI在宿主細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，使酵母宿主胞具有合成雜合型糖鏈的能力。

2、 首先用PCR方法調(diào)取人gnt1編碼區(qū)DNA片段，用編碼釀酒酵母MNN9高爾基體定位信號(hào)的114bpDNA序列替換人GnTI原有的高爾基體定位信號(hào)的編碼序列，并在gnt1編碼區(qū)的下游連接Myc表達(dá)標(biāo)簽的編碼序列。將該DNA嵌合片段mnn9-gnt1-myc克隆至畢赤酵母表達(dá)載體pAO815，使其受控于表達(dá)載體醇氧化酶(AOX)啟動(dòng)子，得到畢赤酵母表達(dá)載體pAO815-mnn9-gnt1-myc(簡(jiǎn)稱pAgm)，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS1

3、15菌株，得到轉(zhuǎn)化子GS115-pAgm。 以熒光物質(zhì)氨基萘磺酸(ANTS)標(biāo)記的甘露五糖(Man5GlcNAc2)和UDP-乙酰葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)為底物，檢測(cè)轉(zhuǎn)化子GS115-pAgm破菌上清液中GnTI的活性，反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行熒光輔助糖電泳(Fluorophore-assistedcarbohydrateelectrophoresis，F(xiàn)ACE)分析。電泳結(jié)果顯示，經(jīng)轉(zhuǎn)化子GS115-pAgm破菌上清液作用的Man