c--Fos在TGF--β1促進(jìn)卵巢癌α1，2--巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)中的調(diào)控作用.pdf

1、卵巢癌是常見的女性生殖系統(tǒng)腫瘤，在美國2013年有22，240新增病例和14，030死亡比例，成為導(dǎo)致婦女死亡的第五大惡性腫瘤。因此，關(guān)于卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制研究一直是婦科學(xué)者研究探討的重點(diǎn)。
　　哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞被膜由糖脂、糖蛋白和蛋白多糖等構(gòu)成，通常也稱為糖被，糖復(fù)合物。在糖基轉(zhuǎn)移酶的催化作用下單糖、寡糖或多糖鏈以共價(jià)鍵的形式被連接到肽鏈的特定糖基化位點(diǎn)，稱蛋白質(zhì)糖基化。腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的一個(gè)重要的特征就是細(xì)胞表面糖基

2、化的異常。Lewis y是含有雙巖藻糖基的寡糖鏈，在上皮性卵巢癌中表達(dá)增高，其合成的關(guān)鍵限速酶是α1，2-FT。轉(zhuǎn)染α1，2-FT基因FUT1的卵巢癌細(xì)胞，不僅Lewis y表達(dá)的顯著增加，且細(xì)胞的增殖能力、侵襲能力、化學(xué)藥物耐藥性都明顯的增強(qiáng)。
　　AP-1主要由Jun和Fos家族成員組成，在細(xì)胞因子，生長因子，細(xì)菌，感染炎癥等多種刺激下，Jun和Fos蛋白形成的同源或異源二聚體與特定的DNA靶序列結(jié)合，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄活性。F

3、UT1啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)存在AP-1反應(yīng)元件，c-Jun能夠特異性結(jié)合于FUT1啟動(dòng)子，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，增加α1，2-FT和Lewis y的表達(dá)
　　TGF-β1能夠調(diào)節(jié)正常生理細(xì)胞增殖、分化、運(yùn)動(dòng)性、凋亡、胚胎生長發(fā)育，血管形成等，但同時(shí)能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、遷移和侵襲，是一種多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，在惡性腫瘤中，TGF-β1高表達(dá)與Lewis y高表達(dá)呈正相關(guān)，卵巢癌細(xì)胞TβRⅠ和TβRⅡ中均含有Lewis y結(jié)構(gòu)。TGF-β1與細(xì)

4、胞膜上受體結(jié)合后，除激活Smads通路外，也激活其它的信號途徑（如MAPKs，PI3Ks等通路）調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。AP-1是MAPKs，PI3Ks及Smads信號通路重要效應(yīng)因子，其表達(dá)及活性受信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)，而信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常激活在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著關(guān)鍵性作用
　　目的：
　　我們的前期研究證實(shí)了FUT1啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)存在AP-1反應(yīng)元件，c-Jun能夠特異性結(jié)合于FUT1啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)α1，2-FT轉(zhuǎn)錄表達(dá)，增加L

5、ewis y抗原的表達(dá)。那么，在本研究中我們在前期工作的基礎(chǔ)上，采用Realtime RT-PCR、Western blot、染色質(zhì)免疫共沉淀等方法，研究c-Fos在TGF-β1誘導(dǎo)卵巢癌α1，2-FT表達(dá)中的作用，推測TGF-β-＞AP-1-＞α1，2-FT-＞Lewis y-＞TβR的信號通路。
　　方法:
　　第一部分:免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色法檢測三組卵巢癌細(xì)胞中c-Fos的表達(dá);Real time PCR方法檢測卵巢癌

6、組織及正常卵巢組織中c-Fos及α1，2-FT mRNA的表達(dá);免疫組織化學(xué)染色法檢測上皮性卵巢癌組織、交界性卵巢上皮性腫瘤、良性卵巢上皮性腫瘤及正常卵巢組織中c-Fos的表達(dá)。
　　第二部分:Western blot檢測不同濃度TGF-β1處理后三組卵巢癌細(xì)胞c-Fos、c-Jun的表達(dá);分別用c-Fos表達(dá)載體、c-Fos siRNA、TGF-β受體抑制劑、JNK通路抑制劑處理卵巢癌細(xì)胞CAVO3，Western blot檢測

7、c-Fos、Lewis y及MAPKs通路信號分子p-JNK、JNK、p-P38、P38、p-ERK、ERK的表達(dá);雙螢光素酶報(bào)告基因法檢測c-Fos/AP-1對α1，2-FT基因啟動(dòng)子活性的影響;ChIP方法鑒定c-Fos、c-Jun與α1，2-FT基因啟動(dòng)子結(jié)合。
　　第三部分:TGF-β1作用下，c-Fos表達(dá)載體及c-Fos siRNA分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞:MTT法檢測細(xì)胞生長情況;克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測克隆形成率;Trans

8、well法檢測細(xì)胞體外侵襲能力。
　　結(jié)果:
　　第一部分:免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法顯示惡性程度高的卵巢癌細(xì)胞系中c-Fos在胞漿和胞核都表達(dá)增高，在惡性程度相對低的卵巢癌細(xì)胞系中主要在細(xì)胞核表達(dá);Real time PCR方法顯示在卵巢癌組織中c-Fos及α1，2-FT mRNA的表達(dá)高于正常卵巢組織，且二者在卵巢癌組織中的表達(dá)呈顯著正相關(guān);免疫組織化學(xué)染色法顯示c-Fos在卵巢癌和交界性卵巢上皮性腫瘤組織中的表達(dá)顯著高于良性

9、卵巢上皮性腫瘤和正常卵巢組織，且c-Fos在卵巢癌組織中的表達(dá)與Lewis y呈顯著正相關(guān)。進(jìn)一步分析c-Fos在卵巢癌中的表達(dá)與組織分化、手術(shù)病理分期有關(guān)，與病理類型及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。
　　第二部分:在卵巢癌細(xì)胞中c-Fos和c-Jun的表達(dá)與TGF-β1呈明顯的劑量依賴關(guān)系。c-Fos siRNA、TGF-β受體抑制劑、JNK通路抑制劑處理卵巢癌細(xì)胞后，c-Fos和Lewis y表達(dá)水平降低，同時(shí)MAPKs通路的下游信號分

10、子p-P38、p-JNK蛋白表達(dá)降低。卵巢癌細(xì)胞過表達(dá)c-Fos后，Lewis y表達(dá)增加，p-P38、p-JNK蛋白表達(dá)亦增加，但是在本研究中ERK和p-ERK均沒有明顯變化。前期已構(gòu)建FUT1啟動(dòng)子螢光素酶報(bào)告基因載體，螢光素酶法驗(yàn)證其具有轉(zhuǎn)錄活性;相比只轉(zhuǎn)染c-Jun表達(dá)載體，共轉(zhuǎn)染c-Fos和c-Jun可以顯著增加FUT1啟動(dòng)子的螢光素酶活性，但是單獨(dú)轉(zhuǎn)染c-Fos并不能提高FUT啟動(dòng)子的熒光素酶活性。ChIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了c-Fo

11、s能夠特異性結(jié)合于包含AP-1結(jié)合位點(diǎn)的FUT1啟動(dòng)子區(qū)域。
　　第三部分:MTT、克隆形成實(shí)驗(yàn)和Transwell的結(jié)果顯示，c-Fos siRNA可以抑制TGF-β1的促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲的作用;而過表達(dá)c-Fos則可以促進(jìn)其作用。
　　結(jié)論:
　　第一部分:c-Fos在惡性程度高的卵巢癌細(xì)胞中胞核和胞漿都有高表達(dá)，在卵巢癌組織中表達(dá)也顯著增高，且與α1，2-FT mRNA及Lewis y表達(dá)顯著正相關(guān)。