利用體外甲狀腺濾泡模型研究甲狀腺轉錄因子在調控甲狀腺功能中的作用.pdf

1、目的：
　　體外構建二腔室甲狀腺濾泡模型，通過慢病毒載體過表達甲狀腺轉錄因子（TTF-1、PAX-8）后檢測模型二腔室中甲狀腺激素的合成變化，以探討甲狀腺轉錄因子在調控甲狀腺功能中的作用。
　　方法：
　　1.取對數生長期的人甲狀腺上皮細胞株，將其培養(yǎng)于Transwell培養(yǎng)板（Corning?3450）內用于構建二腔室模型，待細胞完全融合隔離了上下腔后，便形成了二腔室模型。以此模型為研究對象，以培養(yǎng)于6孔板的單層細胞

2、作為對照，在基礎培養(yǎng)基添加合適濃度碘、1mIU/L TSH，繼續(xù)培養(yǎng)36小時，采用直接化學發(fā)光法檢測培養(yǎng)液中的FT3、FT4、Tg，采用砷鈰催化分光光度測定方法檢測碘濃度。
　　2.根據GenBank的基因序列設計引物，采用PCR克隆TTF-1、PAX-8序列全長，經EcoRI和BamHI雙酶切的片段與pLVX-puro連接后轉化E.coli感受態(tài)細胞，在含有氨芐青霉素的LB平板上篩選陽性轉化子進行測序鑒定。重組慢病毒載體構建完成

3、后，應用PEI共轉染293T細胞獲得重組慢病毒，獲得的病毒上清經滴度測定后可轉染二腔室模型。
　　3.用空載慢病毒轉染的二腔室模型作為對照組，以過表達（TTF1、PAX-8）慢病毒轉染的二腔室模型作為實驗組，采用直接化學發(fā)光法檢測培養(yǎng)液中的FT3、FT4、Tg，采用砷鈰催化分光光度測定方法檢測碘的濃度。
　　結果：
　　1.二腔室模型FT3、FT4合成及攝碘量比單層細胞組顯著增加；
　　2.過表達TTF-1及PA