自噬在正常和糖尿病心肌缺血后適應(yīng)的作用研究.pdf

1、目的:本課題旨在研究自噬在正常血糖，糖尿病和糖尿病胰島素治療大鼠心肌缺血后適應(yīng)的活化及其在心肌缺血后適應(yīng)中的作用。還研究了血糖正常和糖尿病患者心肌缺血后適應(yīng)對(duì)自噬活性的影響。
　　方法:大鼠實(shí)施心肌缺血后適應(yīng)的方案為:再灌注10秒，缺血10秒，重復(fù)3次，在再灌注120分鐘后，用2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）和伊文思藍(lán)染色確定缺血后適應(yīng)對(duì)心肌梗死面積的影響。用電鏡觀察心肌缺血后適應(yīng)后，心肌的形態(tài)學(xué)和自噬活性的改變，運(yùn)用自噬的

2、抑制劑（3-MA）研究自噬在心肌缺血后適應(yīng)中的作用，用Western-blot檢測心肌LC3-II, Beclin1, LAMP-2，cathepsin D, Bcl-2和Bad蛋白表達(dá)水平的變化，用RT-PCR檢測LC3和Beclin1 mRNA在大鼠和病人表達(dá)水平的變化。
　　結(jié)果：
　　1.心律失常評(píng)分
　　與對(duì)照組相比，在正常血糖大鼠(2.3±1.0 vs1.6±1.0, P=0.023)，2周糖尿病大鼠（2.

3、1±1.0 vs1.5±1.0, P=0.027）,2周糖尿病胰島素治療大鼠（2.2±1.0 vs1.4±1.0, P=0.021）和4周糖尿病胰島素治療大鼠（2.7±1.0 vs1.8±1.0, P=0.019）心肌缺血后適應(yīng)組心律失常評(píng)分顯著降低。與心肌缺血后適應(yīng)組相比，心肌缺血后適應(yīng)+3-MA組心律失常評(píng)分顯著升高(P<0.05)。
　　在糖尿病大鼠（4、6周）和糖尿病胰島素治療大鼠（6周），缺血后適應(yīng)組和對(duì)照組之間心律失常

4、評(píng)分無明顯差異(P＞0.05)。
　　2.心肌缺血后適應(yīng)對(duì)心肌梗死面積的影響
　　與對(duì)照組相比，在正常血糖大鼠(60.05±3.75%vs34.43±1.81%, P<0.01)，2周糖尿病大鼠（54.45±2.03% vs42.61±2.53%, P<0.01），2周糖尿病胰島素治療大鼠（53.34±3.3%vs39.61±1.57%, P<0.01）和4周糖尿病胰島素治療大鼠（58.17±3.8%vs48.57±2.23

5、%, P<0.01）心肌缺血后適應(yīng)組心肌梗死面積顯著減少。
　　在糖尿病大鼠（4、6周）和糖尿病胰島素治療大鼠（6周），缺血后適應(yīng)組和對(duì)照組之間心肌梗死面積無明顯差異(P＞0.05)。
　　3.電鏡結(jié)果
　　在正常血糖大鼠，糖尿病大鼠（2周、4周）和糖尿病胰島素治療大鼠（2周、4周），對(duì)照組和假手術(shù)組極少或者沒有觀察到自噬空泡，而在心肌缺血后適應(yīng)組觀察到大量的自噬空泡，與對(duì)照組和假手術(shù)組相比，自噬空泡的數(shù)量顯著增多，差

6、異具有顯著性(P<0.05)。
　　在糖尿病大鼠（6周）和糖尿病胰島素治療大鼠（6周），心肌缺血后適應(yīng)組呈現(xiàn)出凋亡的特征:細(xì)胞皺縮，胞漿致密，核染色質(zhì)邊集和濃縮。
　　4.心肌缺血后適應(yīng)對(duì)心肌LC3, Beclin1表達(dá)水平的影響
　　在正常血糖大鼠，糖尿病大鼠（2周、4周）和糖尿病胰島素治療大鼠（2周、4周），與對(duì)照組和假手術(shù)組相比，心肌缺血后適應(yīng)組LC3-II和Beclin1的蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，

7、LC3和Beclin1的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。
　　在糖尿病大鼠（6周）和糖尿病胰島素治療大鼠（6周），與對(duì)照組和假手術(shù)組相比，心肌缺血后適應(yīng)組LC3-II和Beclin1的蛋白表達(dá)水平無明顯差異(P＞0.05)，LC3和Beclin1的mRNA表達(dá)水平無明顯差異(P＞0.05)。
　　5.心肌缺血后適應(yīng)對(duì)心肌LAMP-2, cathepsin D蛋白表達(dá)水平的影響
　　在正常血糖大鼠，糖尿病大鼠（

8、2周、4周）和糖尿病胰島素治療大鼠（2周、4周），與對(duì)照組和假手術(shù)組相比，心肌缺血后適應(yīng)組LAMP-2, cathepsin D的蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。
　　在糖尿病大鼠（6周）和糖尿病胰島素治療大鼠（6周），與對(duì)照組和假手術(shù)組相比，心肌缺血后適應(yīng)組LAMP-2, cathepsin D的蛋白表達(dá)水平無明顯差異(P＞0.05)。
　　6.自噬抑制劑3-MA對(duì)心肌梗死面積的影響
　　與心肌缺血后適應(yīng)組相比

9、，在正常血糖大鼠(58.95±3.25% vs34.43±1.81%, P<0.01)，2周糖尿病大鼠（51.28±2.03%vs42.61±2.53%, P<0.01）和2周糖尿病胰島素治療大鼠（52.47±2.3% vs39.61±1.57%, P<0.01）和4周糖尿病胰島素治療大鼠（55±3.2%vs48.57±2.23%, P<0.01），心肌缺血后適應(yīng)+3-MA組心肌梗死面積顯著升高。與對(duì)照組相比，在正常血糖大鼠(60.05

10、±3.75%vs53.41±3.01%, P<0.01)，2周糖尿病胰島素治療大鼠（53.34±3.3%vs43.61±1.57%, P<0.01），3-MA組心肌梗死面積明顯減少。
　　在4周糖尿病大鼠，與對(duì)照組相比，缺血后適應(yīng)+3-MA組心肌梗死面積明顯減少(p<0.05)。
　　7.3-MA對(duì)心肌LC3, Beclin1表達(dá)的影響
　　在正常血糖大鼠，糖尿病大鼠（2周、4周）和糖尿病胰島素治療大鼠（2周、4周），

11、與心肌缺血后適應(yīng)組相比，心肌缺血后適應(yīng)+3-MA組LC3-II, Beclin1的蛋白和LC3,Beclin1mRNA表達(dá)水平被3-MA明顯抑制(p<0.05)。
　　8.心肌Bcl-2和Bad表達(dá)水平的改變
　　在正常血糖大鼠，糖尿病大鼠（2周）和糖尿病胰島素治療大鼠（2周、4周），與對(duì)照組和假手術(shù)組相比，心肌缺血后適應(yīng)組 Bcl-2的蛋白表達(dá)水平顯著升高(p<0.05)；Bad的蛋白表達(dá)水平顯著降低(p<0.05)。與心

12、肌缺血后適應(yīng)組相比，心肌缺血后適應(yīng)+3-MA組Bcl-2的蛋白表達(dá)水平顯著減低(p<0.05)；Bad蛋白表達(dá)水平顯著升高(p<0.05)。
　　在糖尿病大鼠（4周、6周）和糖尿病胰島素治療大鼠（6周），與對(duì)照組和假手術(shù)組相比，心肌缺血后適應(yīng)組Bcl-2的蛋白表達(dá)水平顯著降低(p<0.05)； Bad的蛋白表達(dá)水平顯著升高（p<0.05)。
　　9.病人LC3, Beclin1 mRNA表達(dá)水平的改變
　　與對(duì)照組相比

13、，血糖正常和糖尿病患者LC3, Beclin1 mRNA表達(dá)水平顯著升高(p<0.05)。
　　結(jié)論：在血糖正常，糖尿病大鼠（2周）和糖尿病胰島素治療大鼠（2周、4周），活化的自噬在心肌缺血后適應(yīng)中，對(duì)心肌起保護(hù)作用；然而，在糖尿病大鼠（4周）活化的自噬參與心肌的損傷過程；在糖尿病大鼠（6周）和糖尿病胰島素治療大鼠（6周），心肌缺血后適應(yīng)對(duì)心肌的保護(hù)作用缺失與凋亡性細(xì)胞死亡的發(fā)生有關(guān)。血糖正常和糖尿病患者心肌缺血后適應(yīng)LC3, B