高密度脂蛋白及載脂蛋白apoAI研究.pdf

1、第一章HDL和apoAI抑制脂質(zhì)筏介導(dǎo)的抗原提呈
　　目的:甲基-β-環(huán)糊精(MCD)去除抗原提呈細(xì)胞脂質(zhì)筏內(nèi)膽固醇可抑制抗原提呈和T細(xì)胞激活，然而介導(dǎo)細(xì)胞膽固醇流出的高密度脂蛋白(HDL)和載脂蛋白AI（apoAI）是否具有相似作用尚不清楚。
　　方法：用氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激骨髓來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞成熟。然后將抗原負(fù)載的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞與HDL和apoAI共同孵育，檢測(cè)細(xì)胞抗原提呈能力的變化，并測(cè)定HDL和apo

2、AI對(duì)脂質(zhì)筏內(nèi)膽固醇含量的影響。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡進(jìn)一步觀察HDL和apoAI對(duì)脂質(zhì)筏內(nèi)MHCⅡ類分子蛋白含量的影響。
　　結(jié)果：Ox-LDL可以將骨髓來(lái)源的未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞誘導(dǎo)為成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞。將抗原負(fù)載的樹(shù)突狀細(xì)胞與HDL和apoAI共同孵育后，樹(shù)突狀細(xì)胞的抗原提呈和T細(xì)胞激活能力降低。并且該降低程度與HDL和apoAI介導(dǎo)的細(xì)胞膽固醇流出的增加程度相平行。給予HDL和apoAI孵育后的樹(shù)突狀細(xì)胞補(bǔ)充膽固醇可以恢復(fù)其抗原提

3、呈和T細(xì)胞激活能力。分離樹(shù)突狀細(xì)胞脂質(zhì)筏，結(jié)果表明HDL和apoAI降低細(xì)胞脂質(zhì)筏內(nèi)膽固醇含量。并通過(guò)激光共聚焦顯微鏡證實(shí)HDL和apoAI減少細(xì)胞脂質(zhì)筏內(nèi)MHCⅡ類分子蛋白含量。
　　結(jié)論：HDL和apoAI通過(guò)介導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞膽固醇流出，破壞細(xì)胞膜脂質(zhì)筏，從而抑制細(xì)胞MHCⅡ類分子抗原提呈。
　　第二章 ABCA1介導(dǎo)apoAI形成新生HDL的模型
　　目的：ApoAI通過(guò)細(xì)胞跨膜蛋白ABCA1介導(dǎo)，接受來(lái)自細(xì)胞的膽

4、固醇和磷脂，形成新生HDL。但是，這一過(guò)程分子水平的機(jī)制至今仍然不清楚，本研究旨在闡明ABCA1介導(dǎo)的由apoAI形成新生HDL的機(jī)制。
　　方法：將野生型(WT) ABCA1及來(lái)源于丹吉爾病的變異型ABCA1(W590S和C1477R)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞。檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的apoAI結(jié)合能力，將胞膜內(nèi)面脂質(zhì)轉(zhuǎn)移至胞膜外面的能力，以及膽固醇流出至apoAI和?；悄懰徕c(NaTC)的能力。用監(jiān)測(cè)蛋白解折疊和脂化狀態(tài)的熒光分

5、子標(biāo)記apoAI，所得標(biāo)記蛋白分別稱作apoAI解折疊標(biāo)記物和apoAI脂化標(biāo)記物，用以檢測(cè)apoAI自身蛋白解折疊和脂化狀態(tài)。
　　結(jié)果：與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染W(wǎng)T和W590S ABCA1的細(xì)胞與apoAI結(jié)合能力增加，而轉(zhuǎn)染W(wǎng)T和C1477R ABCA1的細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，其將脂質(zhì)從胞膜內(nèi)面轉(zhuǎn)移至胞膜外面的能力增加。說(shuō)明這兩個(gè)基因突變型分別缺失了ABCA1的兩個(gè)不同且相互獨(dú)立的功能。在膽固醇流出實(shí)驗(yàn)中，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染W(wǎng)590S

6、ABCA1和C1477R ABCA1的兩個(gè)細(xì)胞系對(duì)apoAI的膽固醇流出能力均降低約50％，說(shuō)明ABCA1的這兩個(gè)不同的功能對(duì)于膽固醇流出的能力都是不可或缺的，而且只有同時(shí)兼具兩個(gè)功能才能使細(xì)胞膽固醇流出達(dá)到最大效率。在非細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，用apoAI和DMPC脂質(zhì)體組建重組高密度脂蛋白(rHDL)，apoAI熒光標(biāo)記物表明隨著rHDL的形成，apoAI蛋白處于解折疊和被脂化狀態(tài)。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，WT和這兩個(gè)變異型ABCA1的細(xì)胞表面均出現(xiàn)ap

7、oAI蛋白解折疊現(xiàn)象，而未轉(zhuǎn)染ABCA1的細(xì)胞則無(wú)apoAI蛋白解折疊。但是，apoAI蛋白脂化現(xiàn)象沒(méi)有在表達(dá)ABCA1的細(xì)胞表面觀察到。不過(guò)在用apoAI脂化標(biāo)記物與表達(dá)ABCA1的細(xì)胞孵育24小時(shí)后，在培基中可測(cè)到被脂化的apoAI，為細(xì)胞表面解離下來(lái)的新生HDL。
　　結(jié)論：ApoAI結(jié)合能力和胞膜脂質(zhì)轉(zhuǎn)移能力是ABCA1的兩個(gè)不同且相互獨(dú)立的功能，并且都可以使apoAI在細(xì)胞表面解折疊，然后脂化形成新生HDL。依據(jù)本研究結(jié)